耐辐射球菌类胡萝卜素活性基团合成酶的研究

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans, DR)以对电离辐射,UV辐射,干燥以及DNA损伤试剂具有超强的抗性而著称,它能在几个小时内准确地修复由辐射产生的几十个双链DNA碎片(double-strand breaks, DSBs)。耐辐射球菌所具有的抗性能力主要归功于其体内高效的DNA修复系统和抗氧化系统。电离辐射所产生的约80%DNA损伤是由辐射水解形成的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)攻击DNA造成的,负责清除活性氧自由基的抗氧化系统对DR菌的辐射抗性有着重要的贡献。类胡萝卜素作为抗氧化系统非酶类的一种,能有效的清除单线态氧(1O2)等活性氧自由基,而DR菌的主要类胡萝卜素产物deinoxanthin中的特殊活性基团如C-3′,4’双键、C-1′羟基、C-4酮基对其活性功能有着重要的影响。

因此,对这些活性基团合成酶的研究能够帮助我们阐明DR菌类胡萝卜素的合成途径,并更好地理解特殊活性类胡萝卜素对DR菌极端抗性的贡献。本文研究主要是围着类胡萝卜素活性基团合成酶的功能展开的研究,主要内容和研究结果如下：

1.通过生物信息学方法我们发现DR菌中存在编码甲氧基链孢红素脱氢酶(CrtD)的同源物DR2250,并利用PCR方法构建了DR2250的缺失突变株R1ΔcrtD。通过比较突变株R1ΔcrtD与野生型R1的类胡萝卜素组成发现,R1ΔcrtD主要色素产物为3′,4′-dihydrodeinoxanthin,与R1中主要产物deinoxanthin比较,在C-3′,4’位各多了一个氢原子,这表明DR2250编码C3′,4′-脱氢酶。进一步利用质粒共转化方法检验DR2250蛋白具体的功能,结果得到DR2250所催化的底物是具有选择性的,它不能催化Ψ末端的番茄红素,而只能催化经过羟基化修饰的Ψ末端。这也证实在耐辐射球菌体内DR2250催化的C-3′,4’位的脱氢反应是发生在C-1′的羟基化之后。对比R1和R1ΔcrtD在氧化胁迫条件下的生存率得知,突变株的抗氧化能力要比野生型低,并且无论是否在氧化处理条件下突变株R1ΔcrtD中ROS水平要高于野生型R1。

胡萝卜素

比较R1和R1ΔcrtD中主要色素产物自由基清除能力的结果表明,3′,4′-dihydrodeinoxanthin作为突变株体内主要的产物比野生型中deinoxanthin的自由基清除能力低。这些结果证明DR2250负责的C-3′,4’位的脱氢反应对deinoxanthin的抗氧化活性是有影响的。

2.研究表明类胡萝卜素链末端的C-1羟基基团对色素的抗氧化能力具有重要的作用。我们通过分析参与色素合成基因的临近编码基因发现了一种新类型的C-1′,2′-水合酶DR0091(来自D. radiodurans)和Dgeo2309(来自D. geothermalis)。质粒共转化实验表明它们都能以链孢红素、番茄红素和γ-胡萝卜素为底物,产生羟基化的色素产物。通过构建DR0091缺失突变株R1ΔcruF发现,突变株中类胡萝卜素组成产生了三种非C-1′羟基化产物,进一步证实了DR0091在DR菌体内编码C1′,2′-水合酶。进化树分析DR0091及其同源物与已知的CrtC类型水合酶发现,它们不同于CrtC类型水合酶。

3. Deinoxanthin是一种酮基化的类胡萝卜素,它的合成需要在β环C4位置经过酮基化酶修饰得到。已有研究报道表明DR0093编码β-胡萝卜素酮基化酶,它能将β-胡萝卜素转化为4-酮基-β-胡萝卜素和4,4′-二酮基-β-胡萝卜素。但是DR菌中类胡萝卜素都是单环的,所以DR0093在耐辐射球菌体内具体的功能尚不清楚。我们利用DNA重组技术构建了DR0093缺失突变体R1ΔcrtO,分析其体内的色素组成发了明显的变化,产生了三种非酮基化类胡萝卜素：1-OH-γ-胡萝卜素,1′-OH-3′,4′-双脱氢-γ-胡萝卜素,2,1′-OH-3′,4′-双脱氢-γ-胡萝卜素。

这表明DR0093的缺失导致了deinoxanthin合成途径受到阻断,产生了非酮基化的色素。构建dr0093的补偿质粒到突变株R1ΔcrtO中,补偿株又产生和R1同样的色素组成,这意味着突变株中色素组成的变化完全是由DR0093缺失造成的。在正常生长状态下,野生型R1和突变株R1ΔcrtO并没有差异,而在氧化胁迫条件下,R1ΔcrtO的生存率却比R1发生了明显的下降。比较R1和R1ΔcrtO体内类胡萝卜素的自由基清除能力,我们发现R1ΔcrtO的色素产物DPPH’清除能力要比野生型中的色素低。

由此可以看出,DR0093所负责的酮基化反应对于deinoxanthin的抗氧化活性有着重要的作用。 综上所述,deinoxanthin结构中的活性基团对其抗氧化能力具有重要的贡献,同时,这些活性基团合成酶的研究有助于我们对DR菌中类胡萝卜素生物合成途径的了解。

【关键词】：耐辐射球菌 类胡萝卜素 生物合成途径 C-3′ 4’脱氢酶 C-1′ 2’水合酶 C-4酮基化酶