抗生素及草酊磷对盐藻生长的影响

抗生素及草酊磷对盐藻生长的影响

1)郑州大学医学院细胞生物学实验室郑州450052　2)河南省卫生防疫站郑州450003

男,58岁,研究员,博士生导师,研究方向:基因工程,E-mail:xuelx@371.net

关键词　盐藻;BAR基因;抗生素;草酊磷

中图分类号　Q7;Q17

摘要　目的:研究常用抗生素和草酊磷(Phosphinothricin,PPT)对盐藻生长的影响。方法:在固体培养基中加入不同浓度的卡那霉素、青霉素、链霉素、壮观霉素、利福平和PPT,在液体培养基中加入不同浓度PPT,对盐藻进行选择培养,观察盐藻在选择试剂作用下的生长情况。结果:卡那霉素、青霉素、链霉素、壮观霉素1 600 mg/L时尚不影响固体培养基中盐藻的生长;利福平400 mg/L时可完全抑制固体培养基中盐藻的生长;而PPT 3 mg/L时即可完全抑制固体和液体培养基中盐藻的生长,5 mg/L时可以杀死液体培养基中的盐藻。结论:PPT对盐藻的生长具有很强的抑制作用,在基因工程中,以抗除草剂(BAR)基因作为盐藻的选择标记基因研究盐藻的转化是合适的,草酊磷可以作为有效的选择试剂。

高等植物遗传转化中选择性标记的研究已较为成熟[1,2],而藻类遗传转化选择标记的研究多集中在莱茵衣藻、小球藻、红藻[3]和大型藻类,其他藻类的遗传转化选择标记的研究却寥寥无几[4,5]。为了获得稳定的转基因盐藻株,必须利用选择标记基因对转化与未转化的细胞加以区分,以获得需要的、含有目的基因的藻株。采用常用的选择试剂卡那霉素、青霉素、链霉素、利福平、壮观霉素和草酊磷(Phosphinothricin,PPT),确定适合盐藻基因转化的选择标记基因,以期建立盐藻转化系统。

1　材料与方法

1.1　材料

杜氏盐藻(Dunaliella Salina),本研究室保存。盐藻液体培养基:NaCl 80 g/L,NaHCO30.84 g/L,KH2PO40.068 g/L,MgSO40.12 g/L,Ca-Cl20.06 g/L,FeCl30.54 mg/L,尿素60.1 mg/L高压灭菌,固体培养基为添加10 g/L琼脂制成。链霉素、卡那霉素、壮观霉素、青霉素购自华美生物公司,利福平购自Life Technologies公司,PPT由河南省农作物新品种重点实验室陈占宽研究员惠赠。751型可见紫外分光光度计为上海光学仪器厂产。

1.2　方法

1.2.1 材料的准备

取液体培养7 d的盐藻,调整密度至1×108ml-1用于固体选择培养;取液体培养7 d的盐藻50 ml,加入1 000 ml培养基中扩大培养
5 d,测定吸光度(A)用于液体选择培养。

1.2.2盐藻吸光度测定

用751型可见紫外分光光度计测定300～800 nm波长范围的A。

1.2.3　盐藻在固体培养中对5种抗生素和PPT敏

感性测定:配制不同浓度梯度的抗生素和PPT(见表1)的固体培养基于直径6 cm培养皿中,每种处理设3次重复,平行设置对照组。吸取0.4 ml密度为1×108ml-1的盐藻铺板于含不同抗生素和PPT的固体培养基中,置于适宜条件下培养,观察盐藻在不同抗生素和PPT浓度下的生长情况。