杜氏盐藻RuBisCO小亚基基因的克隆和分析

( 郑州大学 a. 细胞生物学研究室; b. 基础医学院 组胚教研室,中国河南 郑州 450052)

摘 要: 根据莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) 、团藻(Volvox carteri) 、伞藻(Acetabularia cliftonii) 等生物的1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶 / 加氧酶(RuBisCO) 的小亚基 rbcS 基因氨基酸的高度保守序列, 设计一对简并引物,进行 RT-PCR. 209 bp 的 PCR 产物经测序分析及进行氨基酸序列同源性比对, 表明克隆的序列为盐藻 rbcS 基因的 cDNA 片段. 根据该序列信息, 采用 RACE (rapid amplification of cDNA ends) 的方法扩增其 5′上游未知区和 3′下游未知区. 5′RACE 得到的 cDNA 长度为约 300 bp, 3′RACE 得到的长度约 380 bp. 三段序列拼接后cDNA 全长为 878 bp, 其中开放读码框包括 190 个氨基酸. 此 cDNA 序列, 推导成氨基酸序列与已知物种的 rbcS基因相比对, 同源性分别为 V.carteri 78%, C.reinhardtii 75%, A.cliftonii 67%, 据此可推断所克隆的序列为盐藻RuBisCO 的小亚基 cDNA 序列, GenBank 收录号为 AY739272.

关键词: 盐藻; 1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶; 加氧酶; rbcS; RACE

中图分类号: Q754 文献标识码: A 文章编号: 1007-7847(2008)01-0029-06

收稿日期: 2007-10-09; 修回日期: 2008-01-24

基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 30540067)

作者简介: 柴玉荣( 1976-) , 女, 河南商水县人, 郑州大学讲师, 博士, 从事基因工程研究,Tel:0371-67921360,E-mail:yrchai@163.com; 薛乐勋( 1944-) , 男, 河南修武县人, 郑州大学教授, 博士生导师, 通讯作者, 主要从事生物工程方面的研究,Tel:0371-66658322,E-mail:xuelx@371.net.

第 12 卷 第 1 期 生 命 科 学 研 究 Vol.12 No.1

2008 年 3 月 Life Science Research Mar. 2008生 命 科 学 研 究 2008 年

亚基( rbcS) 组成, 其中大亚基由叶绿体基因编码,小亚基由核基因编码, 大亚基起催化作用而小亚基具有调控 RuBisCO 活性的功能。

RuBisCO 也是植物可溶性蛋白中含量最高的一种蛋白质, 约占 50%左右, 因此, 对于 RuBisCO 的研究具有重要的理论意义和应用价值. 在转基因研究中,RuBisCO 的小亚基 rbcS 基因的启动子作为高效表达的调控元件应用也较多。

杜氏盐藻( Dunaliella salina, 简称盐藻) 是一种抗逆性很强的单细胞真核绿藻, 能在 0.05～5mol/L 的盐水中生长、繁殖。

盐藻的突出优点在于培养条件简单、光合自养、抗逆性极佳, 因此用它作为生物反应器生产口服型疫苗或其他药物, 可以无须纯化即可直接服用, 大大降低生产成本。

本研究通过比对现有已知物种的 rbcS 基因的核酸序列和氨基酸序列, 利用简并引物 RT-PCR 和RACE( rapid amplification of cDNA ends, cDNA 末端快速扩增) 方法获得了盐藻 RuBisCO 小亚基rbcS 基因的全长 cDNA 序列, 这为进一步研究盐藻 RuBisCO 的小亚基结构和功能以及下一步从盐藻中克隆高丰度基因 rbcS 的启动子打下基础.

　　1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 藻株和菌株

杜氏盐藻( Dunaliella salina.UTEX 1644 Teod)购 自 美 国 德 州 大 学 ( The University of Texas,USA) , 大肠杆菌 JM109 为本实验室保存.

1.1.2 主要试剂

RNA 提取试剂 TRIzol 购自 Invitrogen 公司;AMV First strand cDNA synthesis Kit 购自上海生物工程公司; 限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶和 pMD18-T 载体均购自宝生物工程有限公司( TaKaRa, 大连) ; 凝胶回收试剂盒和质粒 DNA 提取试剂盒购自杭州维特洁生物公司;FirstChoice RLM-RACE Kit 购自 Ambion 公司.