杜氏盐藻基因组文库的构建

基金项目:国家自然科学基金项目(30270031)

通讯作者:薛乐勋,男,60岁,博士生导师,研究方向:生物工程,Email:lxxue@public2.zz.ha.cn

杜氏盐藻基因组文库的构建

王　宁,刘红涛,侯桂琴,王天云,柴玉荣,薛乐勋

(郑州大学细胞生物学研究室,河南郑州450052)

摘要:目的　构建杜氏盐藻基因组文库,旨在进一步分离和研究杜氏盐藻基因的结构和功能。方法　采用改进的SDS裂解法提取杜氏盐藻基因组DNA,通过限制性内切酶Sau3AI进行部分酶切,用T4 DNA连接酶将目的片段与噬菌体EMBL3载体臂进行连接后转染大肠杆菌LE392。结果　体外包装构建了杜氏盐藻基因组文库,得到重组子数为2.2×104,经测定文库滴度为2.2×105pfu/mL。

结论　构建了杜氏盐藻基因组文库,为进一步筛选盐藻重要基因及其序列分析奠定基础。

关键词:杜氏盐藻;噬菌体EMBL3;基因组文库

中图分类号:R730.54　文献标识码:A　　文章编号:1003-1464(2005)02-0080-03

杜氏盐藻(Dunaliella salina)是无细胞壁的单细胞绿藻,归属于绿藻门,绿藻纲,团藻目,杜氏藻科。该藻

突出的生理特征是能在0.05～5.0 mol/L的盐水中生长,是迄今为止发现的最耐盐的真核生物[1],因此可以直接采用开放式培养,而且大规模培养不需昂贵的发酵罐或其他培养装置,大大降低了生产成本,同时杜氏盐藻本身无毒,富含多种天然维生素和不饱和脂肪酸,食用价值高,因此可作为转基因研究的良好宿主。转基因盐藻生物反应器将可用于生产多种药用蛋白,例如抗肿瘤药物血管抑素等。

基因组文库是本世纪70年代末发展起来的一种分离基因组内基因的技术[2]。它是含有某种生物体全

部基因信息的随机片段的重组DNA克隆群体,完整基因组文库的构建使任何基因的筛选和获得成为可能,

这是人们对生物体基因的结构、功能、表达及其调控进行深入研究的基础。由于目前对杜氏盐藻的遗传学背景知之甚少,它的很多功能基因及其调控序列尚属未知,这些因素大大限制了杜氏盐藻的基础理论和实际应用的研究,因此构建杜氏盐藻基因组文库能够很好地解决上述问题,并为下一步获取杜氏盐藻的重要基因及分析相关调控序列提供前提条件,为转基因盐藻的成功实施奠定了良好的基础。本文成功地构建了杜氏盐藻基因组文库。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　藻株和培养　选用的杜氏盐藻藻株UTEX-LB1644,购自美国Texas大学。杜氏盐藻的培养采用改良的Pick盐藻培养基,培养条件为:温度26℃ ,光照强度4 500 Lux,明暗各12 h。

1.1.2　菌株　大肠杆菌(E.coli)LE392购自Promega公司。

1.1.3　载体　EMBL3载体购自Promega公司。

1.1.4　酶及试剂　限制性内切酶Sau3AI和SalI,T4DNA连接酶,DNA Fragment purification Kit均购自大连宝生物工程有限公司。Packagene?Lambda DNA pack-aging System购自Promega公司。

1.1.5　培养基　杜氏盐藻培养基配方由以色列魏茨曼科学研究所Pick教授提供,具体为:NaCl 2 mol/L,

NaHCO350 mmol/L,KNO35 mmol/L,KH2PO40.2 mmol/L,EDTA 6μmol/L,FeCl32μmol/L,MgSO45 mmol/L,

·80·HENANJOURNALOFONCOLOGYVol.18No.2Apr.2005CaCl20.2mmol/L,MnCl27μmol/L,ZnSO41μmol/L,Co

(NO3)21μmol/L,CuSO41μmol/L,(NH4)6Mo7O241μmol/L。

LB液体培养基:酵母提取物0.5%,胰蛋白胨1%,NaCl 1%;LB固体培养基:LB液体培养基中加入1.5%琼脂。

1.1.6　各种缓冲液的配制　提取缓冲液:Tris-HCl(pH8.0)10 mmol/L;EDTA(pH8.0)100 mmol/L;SDS

0.5%;噬菌体缓冲液:Tris-HCl(pH 7.6)20 mmol/L;NaCl 100 mmol/L;MgSO410 mmol/L。

1.2　方法

1.2.1　盐藻基因组DNA的提取　取10 mL处于对数生长后期的藻液,5 000 r/min离心5 min,取3 mL提取

缓冲液重悬盐藻细胞沉淀,加20μL ProteinaseK(10g/L)混匀后,50℃水浴3 h。继之室温冷却后,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)抽提2次,再用等体积的氯仿抽提1次,取上清,加入1/12体积的5

mol/L醋酸钠及2.5倍体积的无水乙醇,混匀后置于-20℃放置30 min.取出后于4℃12 000 r/min离心10

min,用体积分数为70%(V/V)的乙醇洗涤沉淀两次,真空干燥后溶于200μLTE缓冲液中。

1.2.2　总DNA部分酶切　用限制性内切酶Sau3AI部分酶切基因组DNA,200μL反应体系中含约20μg基因组DNA,1USau3AI,混匀后分装到10个小管中,于37℃水浴中保温,每隔15 min取出一管加EDTA至终浓度10mmol/L后终止反应,最后用0.5%的琼脂糖凝胶电泳(电压2V/cm)检测其部分酶切效果,并据此进行大量酶切。酶切产物用DNA Fragment purification Kit直接纯化。

1.2.3　基因组文库的构建　按照基因组克隆与包装试剂盒说明书进行。包括以下步骤:1)部分酶切产物

与载体EMBL3/BamHI Arms用T4 DNA Ligase进行连接;2)连接产物与包装提取物进行体外包装;3)包装产物梯度稀释后侵染E.coli LE392;4)铺平板培养进行文库滴度测定[5]。

1.2.4　基因组文库的扩增　按文献[4]报道的方法进行。

2　结果

2.1　盐藻基因组DNA的提取　按本文的方法制备的杜氏盐藻细胞总DNA经琼脂糖凝胶电泳检测,DNA的分子量远大于50kb(图1);紫外检测结果为A260/A280=1.8,其浓度估计为1μg/μL。

图1　杜氏盐藻基因组DNA凝胶电泳图

1.杜氏盐藻基因组DNA

2.λDNA/HindIII标准分子量标记marker

2.2　总DNA部分酶切　通过设定不同的浓度梯度,结果表明以30 min为最佳酶切时间,即图2中的第4泳道的反应时间为宜,使酶切的DNA在9～23kb之间较多.酶切产物用DNA纯化试剂盒进行纯化,并用适当体积的纯水洗脱。