大规模盐生杜氏藻cDNA克隆与测序及功能分析

盐生杜氏藻(Dunaliella salina，盐藻)是一种单细胞绿藻，属于绿藻门团藻属。其抗逆性极强，能在0.1-5.5mol的NaCl溶液中生存，是目前发现的唯一能进行渗透压调节的真核光合生物。在适应外界盐浓度的剧烈变化时，一方面以胞内甘油为调节物质维持细胞内外渗透压的平衡；另一方面是通过对细胞内Na~+浓度的有效调节机制，维持渗透压并防止Na~+对细胞的毒害。

本论文开展了盐藻大规模cDNA克隆和测序，目标在于获取全长新基因，即具有完整的编码蛋白质信息的、在各种公开数据库中未曾发表过的、代表成熟mRNA序列的cDNA克隆及其序列。目前，已经测定了约一万个cDNA克隆，包含有2，282个基因种类(Unigene)。在功能研究的基础上，已经向国家知识产权局申请基因专利四项。 在此基础上，我们通过两种高通量功能预测和筛选手段——基因表达谱芯片和生物信息学，将新基因按不同的标准和要求分类并在不同程度上提示新基因的功能。然后，采用各种分子生物学和转基因植物构建技术，按照功能提示进行系统的、旨在认识其功能的实验研究。 生物信息分析是另一种大规模基因功能预测的有效方法。

本文对2，282条基因进行了综合的生物信息分析，包括DNA和蛋白质水平上的相似性分析、蛋白质序列中功能域的预测，按照各种不同基因需求开展的相关信息分析。结果表明，综合的生物信息分析可以为大部分新基因提供有价值的功能提示。在典型案例的分析中，编号为DSG10的新基因仅仅通过生物信息分析便已经初步确定为硝酸盐运输蛋白，在后续的分子生物学实验中证明了该功能预测是完全正确的，并验证了基因芯片对该基因表达变化的分析：在转基因植物中，硝酸盐运输蛋白的表达大幅度地提高了烟草的耐盐性。

通过上述研究，我们不但获得了大量的盐藻cDNA克隆及其序列，其中包含上千种未知新基因，而且建立了一套功能筛选和研究的策略和技术方法，为下一步大规模基因功能研究打下了坚实的基础。

【关键词】：盐生杜氏藻 基因芯片 生物信息学 功能 转基因植物