盐生杜氏藻Dscbr基因的光保护功能及机制研究

光氧化现象会给光合生物造成致命的伤害，为了维持正常生理活动的运行，光合生物自发形成了一套防御保护机制(光氧化削减机制)以减少光氧化破坏。高等植物的早期光诱导蛋白(early light-induced proteins，ELIPs)作为光氧化削减机制的一部分，发挥着重要的修复和保护作用。本论文对高等植物ELIPs的同源基因——盐生杜氏藻(Dunaliella salina)Dscbr(carotene biosynthesis related)基因的转录调控、基因功能及其作用机制进行了初步研究，主要结论如下：

一、盐藻Dscbr基因的转录受强光、盐震扰等非生物胁迫因子诱导，并具有瞬时性特征。 本文采用实时荧光定量PCR的方法，以盐藻18S核糖体RNA基因为内标，对盐藻Dscbr基因在非生物胁迫条件(强光、盐震扰)下的差异表达进行了相对定量分析。

从实验结果可以得出以下结论：(1)盐藻Dscbr基因的mRNA转录受光照强度的正调控。随着光强的增加，Dscbr基因表达量也相应提高，在强光(800μmol m~(-2)s~(-1))处理2h后，其转录量达到最大，继续增加光强至1500μmolm~(-2)s~(-1)时，Dscbr的转录量虽然下降为最大量的40％，但仍保持着较高水平。

(2)盐藻Dscbr基因的mRNA转录具有瞬时性特征。在强光(1500μmol m~(-2)s~(-1))诱导下，其mRNA在2h内快速积累，当光照强度恢复正常(50μmol m~(-2)s~(-1))时，其mRNA在1h内快速降解，2h后已恢复为正常水平。这与高等植物elip基因的mRNA在光胁迫下被瞬时诱导表达的特点一致。

(3)盐震扰可以诱导盐藻Dscbr基因的转录。Dscbr基因转录量在短时间内(4h内)随处理时间相应提高，在4h达到最大值，继续延长震扰时间(至6h)，表达量则会迅速下降接近正常水平(NaCl 1.5M)。此外，Dscbr基因的转录水平在低盐震扰(NaCl 0.5M)的各处理中均高于高盐震扰(NaCl 3.0M)的平行处理，这可能是因为盐藻本身是极端耐盐的生物，对于3.0M的NaCl有较强的适应性，也就是说高盐震扰所造成盐藻的光氧化胁迫程度轻于低盐震扰，而Dscbr基因作为光保护机制的一部分，在低盐震扰带来更为严重的光氧化破坏时，该基因的表达水平也相应更高。

(4)Dscbr基因的瞬时高表达特点可能与其具有光保护和修复作用有关。Dscbr基因的表达受多种非生物胁迫因子的调控，而不是只受某单一因子的影响，据此推测Dscbr基因的瞬时高表达特点可能与强光等多种非生物胁迫造成的光氧化破坏有关，也就是可能与其具有光保护和修复作用有关。

二、通过农杆菌介导的花序浸染法，盐藻Dscbr基因在拟南芥elip／cbr基因的转座突变株中得到遗传转化。 为了鉴定盐藻Dscbr基因的功能，本文特选用拟南芥elip／cbr基因的转座突变株(由日本RIKEN生物资源中心提供，RIKEN BioResource Center编号：PST20631)为转基因植物材料，并取得以下结果：(1)在Dscbr基因ORF的5′引物和3′引物中引入构建表达载体所需的BamHI和SacI限制酶位点，通过双酶切和连接，成功构建了可以在植物中高效表达的载体pBI121—Dscbr，并用冻融法将其转入根癌农杆菌EHA105中；

(2)采用经典的农杆菌介导的花序浸染法，在农杆菌浸染液中加入0.005％表面活性剂Silwet L-77，分批次进行拟南芥elip／cbr突变株的转化；

(3)通过种子消毒方法的改良，建立了一套行之有效的拟南芥种子消毒和无菌苗种植的方法。首先用95％乙醇处理种子30-60sec，然后用15％(v／v)次氯酸钠(含0.05％Tween)摇动浸泡10min，无菌水冲洗5次，最后用0.1％琼脂糖将种子悬浮滴于1／2MS培养基，4℃春化2d，移入25℃，16h正常光照培养。此法适用于拟南芥转化子的选择标记筛选。

三、转Dscbr基因拟南芥的强光耐受性提高到野生水平，从而获得了Dscbr基因具有光保护功能的直接证据。 (1)本文采用改良后的种子消毒方法，将转化后的种子播于卡那霉素抗性培养基(含Km 50mg／L)上进行筛选，共获得76株抗性植株；

(2)提取抗性植株的基因组DNA，用PCR的方法对抗性植株进行了分子生物学鉴定，共获得5株PCR阳性苗，初步证明Dscbr基因已转入拟南芥细胞基因组中，PCR阳性率为6.58％；

(3)在功能分析中，经强光(1000μmol m~(-2)s~(-1))低温(白天7℃／夜晚6℃)处理4d，拟南芥elip基因突变株的叶片出现白化(leaf bleaching)，表现出严重的光氧化现象，而Dscbr基因在拟南芥突变株中组成型表达后，转基因拟南芥的光耐受性恢复到野生(正常)水平。这表明盐藻Dscbr基因与其高等植物elip基因一样具有光保护的功能，在光合生物受到光氧化破坏的保护和修复机制中发挥着重要作用。

四、盐藻Dscbr基因在大肠杆菌系统中实现了高效表达，并纯化出DsCBR融合蛋白。 为研究盐藻Dscbr基因具有光保护功能的作用机理，本文选择成熟、经典的大肠杆菌系统进行Dscbr基因的原核表达，包括：(1)在Dscbr基因ORF的5′引物中引入构建表达载体所需的EcoRI限制酶切位点，同时利用pMD18-T载体自带的SalI酶切位点，通过双酶切将其连接在pET32a中，构建成pET32a-Dscbr原核表达载体，然后将重组质粒转化到表达菌E. coli BL21中；

(2)对融合蛋白的可溶性表达条件进行了优化，经过0.08mM IPTG(终浓度)20℃诱导表达6h后，SDS-PAGE电泳检测表明可溶性的DsCBR蛋白得到大量表达。

(3)通过制备性电泳和透析袋电洗脱法成功纯化出DsCBR重组蛋白，其大小与预期的36.8kDa相符。重组蛋白溶液经甲醇／丙酮沉淀和真空冷冻干燥后保存并用于后续实验。 五、建立了DsCBR蛋白与光合色素的体外重组系统，结果表明DsCBR蛋白具有结合叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素的能力，这一结果为明确Dscbr基因的光保护作用机制提供了重要的参考依据。 本文根据Bradford的考马斯亮蓝法制定牛血清白蛋白(BSA)标准曲线，测定出DsCBR蛋白含量为1.2mg／mL，并采用液氮／室温冻融的重组方法将纯化的DsCBR蛋白与不同的光合色素进行体外重组，建立了高效的重组系统。

重组后所获得的DsCBR蛋白-色素复合体经部分变性凝胶电泳(LDS—PAGE)检测和室温吸收光谱分析，得到如下结论：(1)体外表达的DsCBR蛋白具有结合叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素的能力。与叶绿素b相比，DsCBR蛋白仅与极少量的叶绿素a结合。

(2)大量的类胡萝卜素与DsCBR蛋白结合形成了类胡萝卜素-DsCBR蛋白复合体，这一结果与前人的研究结果类似。

(3)首次证实了藻类CBR蛋白在体外能够结合叶绿素b。在强光胁迫下，生物体内的叶绿素a和b是同时增加的，因此完全有理由推测CBR／ELIP在体内也结合叶绿素b。这一结果对于CBR／ELIP的体内研究具有重要的参考意义。

(4)本文的结果为ELIPs的“色素载体”模型增加了实验依据，并由此推测DsCBR蛋白的光保护作用机制符合这一模型的表述。即当盐藻受到非生物因子胁迫时，细胞内游离的光合色素增多，大量的色素分子极易与氧分子反应产生单线态氧，从而导致光氧化破坏。与此同时，DsCBR蛋白受胁迫因子诱导合成，与游离的光合色素结合形成色素—蛋白复合体，减少了单线态氧的产生，从而保护光合器官免受光氧化破坏，发挥了光保护的作用。

(5)本文中建立的蛋白-色素体外重组系统也为本实验室研究盐藻各种Lhcb与色素的重组及确定其结构和功能的关系提供了一个较理想的重组模式系统。 本文对明确藻类cbr基因功能，揭示光合生物的光保护作用机制以及盐生杜氏藻的综合抗逆机制具有重要的学术参考价值。

【关键词】：盐生杜氏藻 Cbr/Elip基因 胁迫相关蛋白 光保护 色素-蛋白复合体