草甘膦是目前使用最为广泛的一种广谱性除草剂，具有对人畜低毒，低残留，不破坏生态环境，杂草难对之产生抗性等优点，有很高的商业价值。草甘膦作用的靶标酶是EPSP合成酶(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶，5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase)。该酶是催化莽草酸循环途径第六步反应的酶，是细菌、真菌以及植物体内芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)生物合成过程中的一个关键酶。草甘膦就是通过抑制EPSP合成酶活性从而阻断芳香族氨基酸的合成，来灭杀大多数的植物，杂草和农作物皆不例外。
因此，利用基因工程技术，通过改造EPSP合成酶或提高EPSP合成酶的表达量以提高作物对草甘膦的抗性，以扩大草甘膦的应用范围，是当今杂草科学和作物育种领域研究的重要内容。 除此而外，由于莽草酸循环仅仅存在于植物、细菌和真菌中，而在哺乳动物、鱼类、鸟类、爬行动物以及昆虫当中还没有发现该途径的存在，所以EPSP合成酶也被认为是一个潜在的新型抗生素作用的靶位点。因此，针对草甘膦与该酶相互作用的机制，以及寻找与草甘膦有相同作用的其他化合物，科学家们作出了大量的研究，为进一步研究此类抗生素的设计打下了基础。有报道指出缺乏了EPSP合成酶基因的病原菌不能正常存活，当然也不能导致疾病的产生。另外，有研究也证明了与莽草酸途径中其他酶的相互作用也能够产生抑菌的效果。 总之，EPSP合成酶在抗草甘膦农作物以及新型抗生素的设计等方面都有着非常重要的应用价值。
因此，对于酶性质、催化机制以及结构和功能相互关系的研究对于EPSP合成酶的改造以及新型抗生素的设计都有着非常重要的意义。就酶的催化机制而言，在某些方面还存在着截然相反的观点，例如“仅仅是S3P与酶的结合能否改变酶的构象”。有的研究者通过实验指出仅仅是S3P就能够导致酶构象的改变，而另一些研究者却认为只有2个底物都结合在酶上，才能改变酶的构象。因而对新发现的EPSP合成酶的研究将为此类争议性问题提供全新的实验证据。迄今为止，已经从原核和真核生物中纯化出了EPSP合成酶，并且在多个生物中也克隆得到了编码EPSP合成酶的基因(aroA基因)。
鉴于还未见藻类EPSP合成酶基因的相关报道，本文就盐藻的EPSP合成酶基因开展了一系列的研究，并取得了以下结果：
1)克隆了盐藻EPSP合成酶的全长基因。 在实验室前期的工作中，已经通过构建盐藻cDNA文库得到了一段盐藻EPSP合成酶基因的EST序列。在该序列的基础上，通过3’RACE和5’RACE的方法将EST序列向着3’和5’的方向分别延长了约900 bp和1200 bp，经拼接后得到了盐藻EPSP合成酶基因的全长cDNA序列，其中3’末端达到了PolyA尾巴。该cDNA序列已提交到NCBI数据库，GenBank的登陆号为EF051488。
2)通过生物信息学分析初步断定克隆得到的cDNA序列属于盐藻EPSP合成酶基因。 经分析，发现该cDNA编码的最长氨基酸序列与其他物种的EPSP合成酶有着非常高的相似性；同时我们也预测出了在盐藻EPSP合成酶的N端有一段叶绿体转运肽，这与植物的EPSP合成酶是一致的；系统发育分析发现盐藻EPSP合成酶与细菌EPSP合成酶的亲缘关系要比高等植物接近一些；功能结构域的预测结果发现该蛋白具有EPSP合成酶家族特有的模体；三级结构的预测也显示出盐藻EPSP合成酶与大肠杆菌EPSP合成酶在结构上非常一致。这些结果都表明我们克隆得到的cDNA确实属于盐藻EPSP合成酶基因。
3)构建了盐藻EPSP合成酶基因的原核表达体系和并纯化了重组蛋白。 利用表达载体pGEX-4T-1构建了含盐藻aroA基因的重组质粒，并将其转入到了大肠杆菌JM109中进行表达；通过表达条件优化我们发现使用0.03mmol／L的IPTG在30℃的条件下对重组蛋白进行诱导能够最大程度的得到可溶性的EPSP合成酶；在此基础上，利用GST亲和层析柱我们纯化出了融合表达的盐藻EPSP合成酶；最后通过凝血酶的作用，将GST标签蛋白除去，得到了正常大小的重组蛋白，为后续蛋白质性质、结构相关的研究打下了基础。
4)在大肠杆菌体内鉴定了盐藻EPSP合成酶基因的功能。 将含盐藻aroA基因的重组质粒转入到了aroA基因缺失的大肠杆菌ER2799中，结果发现转入的盐藻aroA基因能够互补ER2799中缺失掉的aroA基因的功能，维持大肠杆菌ER2799体内芳香族氨基酸的合成，使其能够在M9最低限度培养基上生长；草甘膦抗性实验证明高表达的盐藻EPSP合成酶能够提高大肠杆菌对草甘膦的耐受性，并且可溶性蛋白的含量越高，大肠杆菌对草甘膦的耐受性越强。这些都说明了我们克隆得到的盐藻EPSP合成酶基因在大肠杆菌体内是以有活性的形式存在的。
5)探讨了底物结合对于酶构象变化的影响。 利用荧光光谱，我们分析了盐藻EPSP合成酶在结合底物后构象的变化情况，为该领域存在的争议问题提供了新的实验证据。研究结果显示仅仅是S3P的结合能导致酶荧光光谱微弱的改变，而酶在同时结合了S3P和PEP后，其荧光光谱变化加剧。因此我们认为仅仅是S3P的结合能够使得酶结构发生小范围的变化，但还不能形成“close”的构象；只有当S3P和PEP都结合到了酶上后，酶才能发生剧烈的构象变化，即从“open”构象变成“close”构象。除此而外，我们还发现，在添加了S3P和无机磷离子的EPSP合成酶中，酶的荧光光谱同样发生了巨大的变化，这可能是因为无机磷离子能部分的占据PEP或者草甘膦在酶上的结合位点，从而与S3P一起改变酶的构象。这解释了部分研究者得到了“S3P-酶”二元复合物晶体为什么以“close”构象存在。
6)培育了草甘膦抗性盐藻株并分析了其产生耐受性的原因。通过此部分实验我们希望获得突变的有草甘膦耐受性的盐藻EPSP合成酶，进而发现一些与草甘膦耐受性相关的氨基酸残基。 通过向盐藻培养基中不断的加入并提高草甘膦选择压，逐步培养出了能够在不同草甘膦浓度下生长的盐藻，但是通过比较草甘膦耐受性盐藻与正常盐藻体内的EPSP合成酶的氨基酸序列，并没有发现任何位点的氨基酸突变。于是，利用实时荧光定量PCR测定了不同草甘膦浓度的抗性盐藻体内EPSP合成酶的表达差异，结果显示2.0mmol／L草甘膦抗性的盐藻体内EPSP合成酶mRNA的表达量是正常盐藻的12倍。因此我们认为所培养的盐藻能对草甘膦产生耐受性的原因是其体内EPSP合成酶的高效表达；进一步的实验证实了盐藻需要一个及其缓慢的过程来高效表达自身的EPSP合成酶，以适应高草甘膦浓度的外界环境。
综上，我们首次从盐藻中分离得到了EPSP合成酶的编码基因；通过原核表达纯化了重组蛋白，并鉴定了该基因的功能；研究了底物结合后盐藻EPSP合成酶的构象变化，为该领域存在的有争议问题提供了新的实验证据；培育了草甘膦耐受性的盐藻，并证实了盐藻体内EPSP合成酶表达量的增加是其产生草甘膦耐受性的原因。
【关键词】：盐生杜氏藻 EPSP合成酶 aroA基因 草甘膦
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