植物在受到高盐(高渗)、干旱和寒冷等胁迫时，体内会产生并积累大量的调渗物以改变细胞的渗透压，防止细胞过度失水。盐生杜氏藻(Dunaliella salina，简称盐藻Ds)是目前发现的世界上最耐盐的真核光合生物，可以在0.1～5.5mol／L NaCl的环境中生存。盐藻作为一种典型的嗜盐生物，调渗物的合成是其主要的耐盐策略。
其适应外界高盐环境主要是通过甘油的合成与转化来调节渗透压，恢复其原来的形状和大小。盐藻细胞内甘油含量与外部NaCl浓度呈线性关系。其甘油代谢的基本过程与酵母细胞中的十分类似，在此代谢途径中，NAD-3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol 3-phosphate dehydrogenase，简称GPD)是甘油合成途径中的关键酶，它在NADH的参与下可催化磷酸二羟基丙酮向3-磷酸甘油的转化。
3—磷酸甘油脱氢酶(GPD)具有多种同工酶形式，广泛的存在于生物体中发挥不同的作用。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞中存在三种GPD同工酶；拟南芥(Arabidopsis thaliana)中也有三种GPD同工酶；杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)GPD同工酶的研究侧重于其天然蛋白的分离和纯化，现已发现三种以NAD为辅基的GPD同工酶；果蝇(Drosophila melanogaster)中存在相同结构基因编码的三种不同NAD-GPD同工酶。盐生杜氏藻(Dunaliella salina)中也存在多种GPD同工酶。
在实验室前期工作中，我们首次在基因水平上对盐藻GPD同工酶进行研究。得到了3条GPD同工酶基因的EST序列，经过比对将其分别命名为NAD-GPD1、NAD-GPD2和FAD-GPD。实验室的前期工作主要侧重于NAD-GPD2的研究，已成功克隆了它的全长基因并已申请专利。在对其进行功能域搜索时发现，GPD2基因同时包含了3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)和3-磷酸甘油磷酸酶(GPP)两个独立完整的功能域，在其他物种的3-磷酸甘油脱氢酶中均未发现如此特殊的结构。
因此，我们推测这可能是盐藻具有极高甘油合成能力的关键所在，即DHAP在盐藻NAD-GPD2具有的GPD和GPP两个活性中心的作用下可以直接合成甘油，这样就可以大大提高盐藻甘油合成的效率。这个推测已经被我们通过Southern blot、Northern blot、Western blot和重组蛋白酶学特性的研究得到了初步的证实，相关的文章发表在《Journal of Plant Physiology》杂志上。在接下来的实验中，我们欣喜的发现盐藻NAD-GPD1同工酶基因经预测也同样具有3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)和3-磷酸甘油磷酸酶(GPP)两个独立完整的功能域，看起来盐藻的NAD-GPD同工酶基因在结构上都具有这两个独立完整的功能域，那么它们在盐藻响应渗透胁迫时是如何分工协作，发挥其各自的调渗机制的呢?这就是本论文的研究目的。
本论文从基因和蛋白水平上分别对DsGPD1进行了研究，具体内容如下： 1、盐藻GPD1不同功能域基因片段的克隆。通过RT-PCR的方法分别克隆得到DsGPD1的两个不同功能域的基因片段，GPD1.8和GPD1.1，并对其进行了相应的生物信息学分析，为证明盐藻中确实存在NAD-GPD1基因的不同功能域提供实验证据。此处为了方便表述，根据基因长度，把DsGPD13-磷酸甘油磷酸酶和3-磷酸甘油脱氢酶两个功能域合在一起的基因片段命名为GPD1.8，将3-磷酸甘油脱氢酶这一个功能域的基因片段命名为GPD1.1。
2、盐藻GPD1不同功能域基因片段GPD1.8和GPD1.1的原核表达及体外酶活测定。将GPD1.1功能域克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a中，进行原核表达，进而仿照Dunaliella tertiolecta NAD-3-磷酸甘油脱氢酶同工酶的研究方法，测定不同浓度NaCl和DTT对DsGPD1 3-磷酸甘油脱氢酶活性的影响。另外，将GPD1.8功能域同样进行原核表达，进而体外测定其GPD和GPP双功能酶活，为DsGPD1的功能验证提供实验证据。
3、通过真核生物酿酒酵母体内功能互补实验，验证盐藻GPD1的功能。将盐藻GPD1基因的不同功能域片段，GPD1.8和GPD1.1分别克隆至酿酒酵母表达载体pYES2中，获得重组质粒pYES-GPD1.8和pYES-GPD1.1，然后通过电击转化的方法将重组质粒分别转入酿酒酵母GPD1Δ菌株中，在高盐棉子糖培养基中添加半乳糖诱导克隆基因的表达，观察DsGPD1基因在耐盐方面对缺陷型酿酒酵母的GPD1基因所起到的互补作用的大小，通过真核体内功能互补为DsGPD1的功能验证提供实验证据。
4、研究了盐藻处于不同胁迫时，其DsGPD1 mRNA的差异表达情况。利用实时荧光定量PCR的方法，研究了经高盐、磷酸盐、氧化以及厌氧等不同外界胁迫作用下盐藻该基因的表达变化情况，为进一步研究盐藻各种3-磷酸甘油脱氢酶同工酶基因在细胞内的分工奠定基础。
【关键词】：盐生杜氏藻 NAD-3-磷酸甘油脱氢酶同工酶 功能域 原核表达 功能互补
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