盐藻淀粉磷酸化酶基因DsSP的克隆和原核表达

影响生态环境和农业生产的因素有很多，而土壤的盐渍化是其重要因素。同时，由于耕地面积的逐渐减少、淡水资源的不足，人类不得不开发、利用大面积的盐碱地、海岸带和滩涂地带。因此，植物的耐盐机理和耐盐植物的培育已成为研究的热点。杜氏盐藻（Dunaliellasalina）简称盐藻，属于绿藻门、真绿藻纲、团藻目、盐藻科、盐藻属，是一种能生长于极端环境下且无细胞壁的单细胞真核绿藻，在0.05mol/L到饱和浓度的盐溶液中都能生存，是最耐盐的真核生物之一，也是研究植物耐盐机制的模式生物。

许多学者的研究证明：外界渗透压改变时，盐藻通过甘油代谢及快速的体积变化来应对。但是，其中进一步的基因表达调控机制及信号传导途径并不清楚。受到高盐胁迫时，盐藻通过淀粉降解合成大量甘油来应对外界渗透压的变化；在淀粉磷酸化酶的作用下，淀粉转化为葡萄糖，随后葡萄糖经过一系列途径生成甘油，而在这个过程中淀粉磷酸化酶发挥关键作用。

目前，尚未有人从盐藻中克隆出淀粉磷酸化酶基因并揭示其基本性质。因此，盐藻淀粉磷酸酶基因的研究，对于揭示盐藻的耐盐机制具有重要意义。为此，本研究从盐藻中克隆淀粉磷酸酶基因，并对其进行了系统的生物信息学分析和原核表达。

主要的实验方法和结论如下：1.采用RT-PCR和RACE的方法从盐藻中克隆出1种淀粉磷酸化酶基因(GenBankaccessionNo.KF061044)命名为DsSP，全长为3560bp，其中5′UTR为48bp，3′UTR为416bp，开放阅读框为3096bp，编码1031个氨基酸。

生物信息学分析表明：该蛋白为亲水性蛋白，无信号肽，无跨膜区域，为非跨膜蛋白，且定位于叶绿体；二级结构含有384个α-螺旋、192个β-折叠和455个无规卷曲；在870-882处有一个磷酸吡哆醛结合位点：EASGTSNMKFSMN；含有5个苏氨酸磷酸化位点，10个酪氨酸磷酸化位点，12个丝氨酸磷酸化位点；三维建模清晰显示该功能位点只包括α-螺旋和无规卷曲；进化分析得出，与衣藻和团藻的淀粉磷酸化酶亲缘关系最近。

将DsSP的开放阅读框克隆到载体pGS-21a上，成功构建了原核表达载体pGS21a-DsSP；将重组载体导入E.coliBL21，IPTG诱导表达，表达形式分析表明融合蛋白在上清和包涵体中均存在；上清蛋白纯化后，获得了纯度较高的可溶性融合蛋白；纯化的上清蛋白采用Bradford法测定，其浓度约为200μg/mL；Westernblot显示，融合蛋白能被抗GST单克隆抗体特异性识别，表明PGS21a-DsSP在E.coli.BL21中成功表达。

本文从盐藻中成功克隆出一种淀粉磷酸化酶基因DsSP，并对其进行了系统的生物信息学分析，通过原核表达获得纯度较高的可溶性融合蛋白质。这些结果，为进一步研究DsSP在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。

【关键词】：杜氏盐藻 淀粉磷酸化酶基因 克隆 生物信息学 原核表达