杜氏盐藻S-腺苷同型半胱氨酸水解酶相互作用蛋白的筛选与鉴定

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocystinehydrolase,SAHH)是甲基化通路中一个关键的限速酶,可逆催化S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocystine,SAH)水解生成腺苷和同型半胱氨酸,SAH是所有依赖S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)转甲基酶的反应产物,作为产物抑制剂SAH水平的增加可以抑制依赖SAM转甲基酶作用,因此SAHH快速分解SAH成为甲基化进行的先决条件。SAHH不但作为生物转甲基化反应的调节者,而且在作为抗寄生虫药物靶点以及治疗肿瘤、艾滋病等重大疾病都有深入的研究。

为了研究杜氏盐藻SAHH的细胞内在分子作用机制,本实验构建S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-SAHH,通过酵母双杂交技术筛选杜氏盐藻细胞cDNA文库与杜氏盐藻SAHH相互作用的蛋白,并通过体外实验Far-Westernblotting、Hispull-down和体内实验免疫共沉淀来验证酵母双杂交的阳性结果。

方法1、SAHH相互作用蛋白的筛选用PCR方法扩增杜氏盐藻SAHH的开放阅读框,酶切鉴定以及测序正确后,将其与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵表达载体pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母细胞中,检测诱饵蛋白对酵母细胞有无毒性及对报告基因是否具有自激活作用。以pGBKT7-SAHH为诱饵蛋白,从杜氏盐藻cDNA酵母文库筛选与SAHH相互作用的蛋白质。经多次筛选获得阳性克隆,并提取酵母质粒与诱饵质粒共转化酵母细胞进行回交实验。

2、相互作用验证通过RACE的方法获得RACK1的全长,构建表达载体pGEX6p-1-RACKl表达GST-RACK1融合蛋白并纯化RACKl蛋白,同时表达pET28(a)+-SAHH融合蛋白并纯化SAHH蛋白。Far-Westernblotting在变性条件下验证SAHH和RACK1之间的相互作用,并用native-PAGE检测活性蛋白SAHH和RACKl的Hispull-down的结果。同时构建哺乳动物免疫共沉淀载体pCMV-HA-SAHH和pCMV-myc-RACKl,转染SV40转化的非洲绿猴肾细胞(COS-7),收集细胞蛋白,进行免疫共沉淀实验,最后SDS-PAGE检测SAHH和RACK1在COS-7中是否存在相互作用。

3、SAHH和RACK1在杜氏盐藻鞭毛长度调控中的作用采用pH休克法处理对数生长期的杜氏盐藻使其脱去双鞭毛,然后正常培养并取不同生长时间的盐藻细胞,提取收集的盐藻细胞总RNA,并反转录为cDNA,设计引物进行实时荧光定量PCR验证在鞭毛再生过程中SAHH和RACK1在转录水平上的变化。

结果：1SAHH相互作用蛋白的筛选成功构建诱饵质粒pGBKT7-SAHH并转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达融合蛋白对宿主酵母细胞均没有毒性。在酵母细胞AH109和Y187诱饵载体均没有激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活报告基因MEL1,因此可以使用报告基因HIS3和ADE2来筛选酵母文库。

以SAHH为诱饵筛选杜氏盐藻cDNA文库,得到255个结果,经过反复筛选得到3个基因,分别为RACK1,MetAPl和eEFlα。其中MetAPl和eEFla参与新合成蛋白质的代谢,而RACK1是一个支架蛋白,又研究发现参与多条信号通路,故选取了RACK1进行后续试验。提取RACK1的酵母重组质粒,与诱饵载体进行回交实验,转化后的酵母细胞生长良好,说明RACKl和SAHH在酵母细胞中存在相互作用。

相互作用的验证通过RACE的方法获得RACK1的全长1175bp,3’UTR167bp含有完整的polyA尾,5’UTR51bp,开放阅读框975bp,一共编码325个氨基酸残基。设计引物扩增RACKl的开放阅读框,成功构建了原核表达载体pGEX6p-1-RACKl,表达了大小为60kDa的活性的融合蛋白GST-RACK1,并进行纯化。同时诱导表达pET28(a)+-SAHH活性蛋白后并对其进行纯化Far-Westernblotting实验证明SAHH和NC膜上复性的RACK1存在相互作用。Hispull-down实验采用native-PAGE方法证明两活性蛋白在体外可以聚合在一起。

将表达载体pCMV-HA-SAHH和pCMV-myc-RACKl共转染到COS-7中,提取细胞蛋白进行免疫共沉淀反应,最后Westernblotting实验证明SAHH和RACK1在COS-7中存在相互作用。SAHH和RACKl在杜氏盐藻鞭毛长度调控中的作用实时荧光定量PCR试验证明在鞭毛再生过程中SAHH的表达变化较大,而RACKl的表达量基本不变。

结论：SAHH和RACKl存在相互作用,并且RACKl可能介导SAHH调控杜氏盐藻鞭毛长度。

【关键词】：S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH) 酵母双杂交 活化的激酶C受体1(RACK1) 蛋白质相互作用