油菜素内酯对盐藻细胞分裂的影响

摘要

外加24-表油菜素内酯(24-epiBL)无论在光下或暗中均可促进盐藻细胞分裂数的增加,激动素只在光下具有这种作用。外界Ca2+浓度升高时,24-epiBL促进细胞分裂的效果更为明显,而EGTA可以抑制24-epiBL引起的促进作用。Verapamil、W7、环己酰亚胺均可抑制盐藻细胞分裂。Ca2+载体A23187在低浓度(0.25μmol/L)时具有促进分裂的作用。可以认为24-epiBL对低等单细胞藻类具有生理作用,并且,其促进盐藻细胞分裂的机制与激动素是不同的,它不仅与Ca2+有关,而且与钙调素也有较密切的关系。

24-表油菜素内酯(24-epibrassinolide,24-epiBL)为油菜素甾醇类(brassinosteroids,BR)物质,这类物质在植物的生长发育过程中起着极为重要的作用,它们可以诱导绿豆上胚轴和黄瓜下胚轴的伸长,促进花粉管的生长,抑制根的生长,促进水稻谷粒的成熟等。自Grove等(1979)提取并鉴定了油菜素内酯的结构以来,人们相继在40种植物体中得到BR(Sakurai和Fujioka1993,Sasse 1997),其中不仅有被子植物和裸子植物,也有低等植物的绿藻类,并且在植物的茎、叶、花和种子等器官中都发现了BR(Arteca 1995),可见它们在植物界中的分布是很广泛的。目前,已从自然界中分离和人工合成了60多种油菜素甾醇类化合物(Kim 1991)。BR对植物细胞方面的作用结果尤其引人注目,它可以影响高等植物细胞的分裂(Clouse等1992,Gaudinova等1995,Wilen等1995,Nakajima等1996),其中Gaudinova等(1995)认为BR对植物细胞分裂的作用可能与细胞分裂素有关。但迄今为止,对BR影响植物细胞分裂的机制涉及甚少。虽然已知它能促进细胞壁的松弛(Zurek等1994)、改变微管的排列方向(Mayumi和Shibaoka 1995)、促进细胞的膨(Clouse 1997)、质子的外排和细胞膜的超极化(Cao和Chen 1995)等,但这些作用并不完全能解释BR对植物细胞分裂影响的内在机制。由于目前对于油菜素甾醇类物质影响植物细胞分裂机制方面的研究结果很少,BR究竟通过何种途径影响植物细胞分裂还不清楚。近年来有人认为Ca2+在植物激素影响细胞分裂时具有关键性作用(Bethke等1995)。为此,我们以盐藻为材料探讨24-表油菜素内酯对植物细胞分裂的作用及其可能与Ca2+有关的作用机制。

1　材料与方法

1.1　盐藻(Dunaliella salina)的培养

参照Chit-laur和Pick(1989)的方法,将盐藻培养在含NaCl 1mol/L的新鲜培养液中。

1.2　细胞计数

参照Schoen(1988)的方法,用血球计数板记数全部小方格中的盐藻数目。每样品至少重复6～8次。计算每毫升盐藻细胞平均数及其标准差。

1.3　药品处理

取培养6 d的新鲜盐藻细胞(处于生长对数期),分别以KT、24-epiBL、CaCl2、EG-TA、Verapamil、A23187、W7、环己酰亚胺按所需浓度(除特别指出外,24-表油菜素内酯的浓度为0.5:145～150mg/L)进行处理,并使其保持在pH8.0,置于恒温培养箱中,条件同盐藻的培养。暗处理在完全避光的恒温培养箱中进行,其它条件完全一样。处理时间均为24 h。

2　结果

2.1　24-表油菜素内酯对盐藻细胞分裂的影响

很低浓度(0.005 mg/L)的24-epiBL对盐藻细胞的分裂就具有促进作用,并且在0.5 mg/L时其促进作用最为显著(图1)。Gaudinova等(1995)报告细胞分裂素可能在24-epiBL对植物细胞分裂的影响中发挥作用,我们也作了kinetin(KT)对盐藻细胞分裂影响的实验。图2表明KT对盐藻细胞的分裂也有作用,在0.25～25 mg/L范围图1　不同浓度24-epiBL处理24 h的盐藻细胞数内均可增强其分裂,其中以2.5 mg/L时促进作用为最大。由此可见,24-表油菜素内酯促进盐藻细胞分裂的作用可能和细胞分裂素有关。然而,我们的实验也表明,在不同的光照条件下,24-epiBL和KT作用的效果并不完全相同(图3)。24-epiBL无论在光照条件下还是在暗中均具有促进盐藻分裂的作用;而KT仅在光照条件下才能促进细胞分裂,在暗环境中它不仅没有促进分裂的功能,而且还有抑制细胞分裂的作用。因此可以认为24-epiBL和KT在促进盐藻细胞分裂的作用上,具有不同的机理。

2.2　24-表油菜素内酯促进盐藻细胞分裂与Ca2+的关系

细胞分裂要求以微管牵动染色体的移动,这时Ca2+是必需的,它能够调节微管的装配。所以我们推测Ca2+在24-表油菜素内酯促进的盐藻细胞分裂中起着某种作用。Bethke等(1995)也认为Ca2+在植物激素对细胞分裂的影响中具有极为关键的作用。因此,我们也想通过此途径阐明24-表油菜素内酯的某些作用机理。我们发现细胞外Ca2+浓度的升高对盐藻细胞的分裂没有明显的影响,而增强了以24-epiBL处理的盐藻细胞的分裂(图4)。Ca2+的螯合剂EGTA可以螯合细胞外Ca2+,使其不能起的盐藻细胞分裂的影响进入细胞质。在0～10 mmol/L范围内,EGTA对盐藻的生长没有明显的影响,但是同时以24-epiBL处理的盐藻细胞则分裂数减少(图5);而外加Ca2+可以解除这种抑制作用(图6)。可见细胞外Ca2+浓度可增强24-表油菜素内酯促进盐藻细胞分裂的作用。可能24-epiBL通过把外界环境中的Ca2+运送至细胞内来调控细胞分裂的。

2.3　24-表油菜素内酯促进盐藻细胞分裂与Ca2+通道及Ca2+载体活性的关系

细胞外Ca2+进入细胞内主要是通过质膜Ca2+通道。Ca2+通道阻断剂Verapamil可以阻断细胞外Ca2+向细胞内的运送。低浓度(0.25μmol/L)的Verapamil对24-epiBL处理的盐藻细胞分裂的抑制作用要比对照明显(图7)。说明24-epiBL处理的盐藻细胞对Verapamil的作用更敏感,它诱导的分裂更多地依赖于Ca2+通道的开放。A23187是Ca2+载体,它可以增加细胞内Ca2+浓度,但它同时又是氧化磷酸化的解偶联剂和ATPase的抑制剂(Pressman1976)。从图8我们可以看到在低浓度时 (小于0.05μmol/L),A23187具有促进盐藻细胞分裂的作用,未以24-epiBL处理的盐藻细胞甚至在A231870.5μmol/L的处理下仍能表现出这种效果。这可能说明未以24-epiBL处理的盐藻细胞对A23187更敏感些。以上两方面的结果提示,24-表油菜素内酯促进盐藻细胞分裂可能是增强Ca2+通道运送Ca2+的能力,通过增加细胞质内Ca2+的浓度,以Ca2+对某些酶和蛋白或基因的调节来促进细胞分裂。

2.4　24-表油菜素内酯促进盐藻细胞分裂与钙调素的关系

钙调素是Ca2+的主要受体蛋白,Ca2+的许多生物学功能是依赖钙调素而完成的。W7是钙调素的专一性抑制剂。图9的结果表明,W70.25μmol/L对24-epiBL处理的盐藻细胞分裂有明显的抑制作用,但对于未用24-epiBL处理的盐藻则并无显著的影响;高于此浓度的W7对两者均表现出持续抑制的趋势。这表明经过24-epi-BL处理的盐藻细胞对W7更敏感,说明24-epiBL促进盐藻细胞分裂与钙调素有关。

2.5　放线菌素D和环己酰亚胺对24-表油菜素内酯促进盐藻细胞分裂的影响

Clouse(1997)指出,油菜素内酯对植物生长发育的作用可能和参与基因的表达调控有关。我们尝试了RNA合成抑制剂———放线菌素D和蛋白质合成抑制剂———环己酰亚胺对盐藻细胞分裂的影响。我们发现,放线菌素D对于同时以24-epi-BL处理的盐藻细胞分裂没有明显的影响,环己酰亚胺则抑制了24-epiBL所引起的盐藻细胞的分裂(数据待发表)。这说明24-

epiBL对盐藻细胞分裂的调节可能主要是在蛋白质合成的水平上进行的。

3　讨论

油菜素内酯对植物细胞分裂的作用目前众说纷纭,在对胡萝卜细胞培养时发现BR只能促进细胞膨大,而不能促进细胞分裂(Bellincampi和Morpurgo 1988);另一些资料显示BR可能抑制了细胞的分裂(Gaudinova等1995,Wilen等1995);也有实验表明,BR可以促进植物细胞的分裂(Clouse等1992),不仅如此,它也可以促进原生质体去分化和细胞壁的重建(Nakajima等1996)。其中一些证据表明油菜素内酯与细胞分裂素相互作用调节细胞分裂。Gaudinova等(1995)认为BR对细胞分裂的调控可能是建立在调节细胞分裂素的水平上达到的,而细胞分裂素促进细胞分裂可能是通过增加细胞质中Ca2+浓度来实现的。我们的结果清楚地表明24-epiBL具有显著促进盐藻细胞分裂的作用。其作用机理与促进分裂的细胞分裂素类物质KT是不同的。24-epiBL在光照条件下和黑暗中都具有促进分裂的作用,说明它在调节细胞分裂的过程中,光信号和(或)光合产物并非关键因素;而在KT的调节机理中光信号和(或)光合产物则是极为重要的。

盐藻是不具有细胞壁结构的单细胞绿藻,类似于高等植物的原生质体,并且我们的结果也与Nakajima等(1996)对植物原生质体的研究结果相似,而不同于Gaudinova等(1995)对植物细胞的研究结果。这说明植物细胞壁也影响油菜素甾醇类物质对细胞分裂作用的实现。

通过以上实验,我们认为,24-表油菜素内酯对盐藻细胞分裂的促进作用可能是通过增加Ca2+通道的开放,从而以较高的细胞质Ca2+浓度经过钙调素的调控作用和(或)Ca2+对其它生理过程的调节作用而达到的。并且,这种作用的实现也可能不需新的RNA的合成,所以,RNA合成抑制剂对其所促进的细胞分裂的影响不明显。有关BR对植物生长发育的调控,一般认为是通过对植物基因表达调控来实现的(Clouse 1996),24-epiBL促进盐藻细胞分裂的作用机制还需进一步研究。综上所述,我们认为,24-epiBL促进盐藻细胞分裂与Ca2+和钙调素有着密切的关系,可能在这种作用中Ca2+作为第二信使与钙调素共同调控着细胞内部的生理过程,从而实现24-epiBL对盐藻细胞分裂的促进作用。

Ca2+和钙调素对细胞内蛋白质及其它物质的调节作用是比较复杂的,为了明确24-epiBL促进盐藻细胞分裂的作用机理,深入研究Ca2+和钙调素的这种调控作用将是我们今后工作的重点。