巴氏杜氏藻番茄红素β-环化酶基因的克隆及其启动子的活性研究

杜氏藻是一种常见的单细胞绿藻，是至今发现的最耐盐的真核生物，能够在高盐浓度、高光照强度及高温度等极端环境下生长，并累积大量的β-胡萝卜素。番茄红素β-环化酶（LycB）是β-胡萝卜素合成的关键酶之一，它可以催化番茄红素合成β-胡萝卜素，藻类及植物高度累积β-胡萝卜素与该酶的基因调控及其酶催化机理直接相关。

本研究克隆并分析了巴氏杜氏藻（LycB基因的基因组序列及其上、下游序列，并通过外源基因的表达验证了LycB启动子在巴氏杜氏藻中的启动子活性和功能。

具体结果如下： 1、根据实验室克隆得到的LycB的cDNA序列，通过数据库分析该序列及其它物种的氨基酸保守序列设计引物，通过分段克隆PCR及染色体步移的方法，克隆获得几乎完整的LycB基因组序列，并对其进行分析。测序结果表明，克隆到的该部分LycB基因组序列含有5863bp，由11个外显子和10个内含子组成。

2、以LycB基因组DNA序列为模板分别设计了两组引物，通过基因组步移的方法，获得LycB基因启动子和终止子序列。并采用Plantpan在线分析LycB基因组DNA上游序列，发现上游序列上含有与光诱导相关的顺式作用元件GATABOX、SORLIP1AT、SORLIP2AT，与盐诱导相关的调控元件GT1GMSCAM4等。

3、将克隆得到的LycB基因组DNA的上、下游片段与报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和博莱霉素抗性基因（ble）构建成外源表达载体，利用电击法将载体转化杜氏藻，通过检测报告基因的表达来验证启动子的活性。转化48h后，荧光显微镜下观察到绿色的藻细胞，并持续到第6天；而在含有博莱霉素的培养平板上，也观察到转化藻的生长。说明巴氏杜氏藻的LycB基因启动子具有活性。

4、采用SOE PCR的方法对LycB启动子上预测的盐调控元件进行缺失处理，并进行实时荧光定量PCR检测，初步证明预测的调控位点可能具有盐调控功能。 杜氏藻LycB基因启动子调控序列的克隆及其与光、盐诱导元件的分析结果，有助于进一步研究杜氏藻β-胡萝卜素合成的代谢调控机制，对于揭示杜氏藻高度累积β-胡萝卜素的分子机理有重要意义。

【关键词】：巴氏杜氏藻 番茄红素β-环化酶 基因克隆 启动子

【学位授予单位】：华南理工大学