盐生杜氏藻cbr基因的克隆及其在烟草中的鉴定

杜氏藻是一种真核单细胞绿藻，可以在0.1～5.5mol／L的NaCl溶液中生存。杜氏藻之所以能耐受盐逆境与其细胞内具有一套独特的渗透压调节机制和β-胡罗卜素合成途径有关。为了从基因水平上研究其耐盐机制，本实验室利用传统的同源克隆的方法成功克隆到盐生杜氏藻cbr基因并将其转入模式植物烟草中，为下一步功能研究打下了实验基础。

本实验研究的主要内容包括：1．利用同源克隆的方法从盐生杜氏藻中顺利克隆到一条250bp的cDNA片段，测序分析发现其同D.bardwail的cbr基因有67.0％的同源性，然后以该片段为基础，利用RACE技术构建了其全长序列；

2．对盐生杜氏藻进行渗透震扰3h、6h、12h、24h、48h，然后利用半定量RT-PCR技术分析了渗透震扰对cbr基因表达的影响，结果发现高渗和低渗震扰对cbr基因表达的影响明显不同；

3．构建中间载体pCAMBIA2301G，再用它和cbr构建了可在植物中高效表达cbr的载体pCAMBIA2301G-cbr，并将该质粒导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中；

4．叶盘法转化烟草(Nicotianatabacum)。烟草叶盘经农杆菌浸染后，在含卡那霉素的MS_2诱导培养基上生长，4周左右再生大量丛生芽，6周左右丛生芽在MS_3培养基中生根，生根率达到70％左右，最后将PCR检测的阳性苗成功移栽到蛭石：沙(1:1)的培养介质中培养；

5．对转基因苗进行分子生物学检测，包括PCR、Southern杂交和RT-PCR，结果显示有27％的再生苗为PCR阳性，对PCR检测阳性苗进行Southern杂交分析，发现cbr基因已整合入烟草的基因基因组 中，部分PCR阳性苗Sou七hern杂交结果却是阴性。随后的RT一PCR分析结果 显示，所选的三棵阳性苗均能扩增出相应条带，说明c厉基因已经转录生成 mRNA。

【关键词】：同源克隆 cbr RACE 转基因烟草 叶盘转化 Southern杂交 RT-PCR