亚心型扁藻细胞核与叶绿体稳定转化系统的构建

亚心型扁藻,又称亚心型四爿藻,是一种单细胞海洋绿藻。该藻在水产养殖、新能源开发等方面有重要的应用价值。为了推动该藻的基础研究进程并提高其应用价值,本文对亚心型扁藻的细胞核与叶绿体遗传转化体系进行了较系统的研究。

首先通过亚心型扁藻对多种常用抗生素和除草剂草丁膦的敏感性实验,确定以草丁膦为筛选压力,其抗性基因bar基因为选择标记基因,构建亚心型扁藻核遗传转化系统。

本文采用基因枪转化法和珠磨法两种方法建立亚心型扁藻的核遗传转化系统。珠磨法转化需要以原生质体为材料,所以我们用鲍鱼酶液去除亚心型扁藻的细胞壁制备原生质体;然后用珠磨法将pEGFP-N1质粒导入原生质体中,观察到了绿色荧光蛋白的瞬间表达,证明珠磨法可用来建立亚心型扁藻的核遗传转化系统。然后利用基因枪法和珠磨法将含有bar基因的质粒pSVB导入亚心型扁藻中,通过草丁膦筛选得到稳定转化的抗性单藻落。根据统计结果发现,珠磨法的转化效率高于基因枪法。

本文采用基因枪法建立了亚心型扁藻的叶绿体遗传转化系统。首先克隆了亚心型扁藻的叶绿体基因组片段rrn16S-trnI和trnA-rrn23S作为同源整合区域;从莱茵衣藻叶绿体转化载体p64D上克隆启动子5’atpA和终止子3’rbcL,作为调控序列;以绿色荧光蛋白基因(gfp)为报告基因,bar基因为选择标记基因,构建了亚心型扁藻叶绿体同源整合载体pPSCG、pPSCB,用基因枪法将两个质粒导入亚心型扁藻细胞。

通过流式细胞仪分选及激光共聚焦显微镜对观察到绿色荧光蛋白在叶绿体中的瞬间表达;转化质粒pPSCB的藻细胞经过草丁膦筛选,获得稳定转化子,检测到bar基因在亚心型扁藻叶绿体中的定点插入和稳定整合。

【关键词】：亚心型扁藻草丁膦bar基因绿色荧光蛋白基因基因枪转化法珠磨法核转化系统叶绿体转化系统

【学位授予单位】：中国科学院研究生院（海洋研究所）