杜氏盐藻叶绿体双筛选载体pchlN-CAT-BAR的构建及转化

杜氏盐藻是一种单细胞真核绿藻,可在0.05-5MNaCl培养液中生长,无细胞壁,呈椭圆形或梨形,有两根等长的鞭毛,胞体内含有一个约占自身体积50%的巨大杯状叶绿体。

目前,在以藻类为生物反应器的研究中,模式生物衣藻的研究已趋于成熟,有关盐藻的探索也在逐步发展,已有许多外源蛋白在盐藻细胞内得到表达。研究中发现,外源基因在盐藻细胞核表达时,常会出现整合不易、表达不稳、基因沉默、位置效应、表达量低等问题,一定程度上限制了核表达系统的实际应用。叶绿体表达系统与之相比具有一定优势：基因组小,遗传背景清晰,外源基因通过同源重组定点整合入基因组,插入位点可人为控制；基因多顺反子形式,可同时调控多个外源基因表达；基因组拷贝数多,外源基因能高效表达；母系遗传,外源基因扩散风险低；除糖基化外,可对表达蛋白进行其他加工修饰。

因此,叶绿体转化成为盐藻转化研究的一个重要方向。此次选用叶绿体为表达系统,利用同源重组的方法,将外源选择标记基因转入无菌纯化的盐藻细胞的叶绿体内并得到表达。而要建立盐藻叶绿体转化体系,构建一个稳定的叶绿体表达载体至关重要。

chlN基因与chIL、chlB基因共同编码光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶(DPOR),该酶广泛存在于以叶绿素为光合色素的生物中,主要参与黑暗条件下叶绿素的合成,三个基因任何一个的破坏都会阻断黑暗条件下叶绿素的合成,但DPOR的阻断不影响转化藻株的正常生长,盐藻还可以通过光依赖性的原叶绿素酸酯还原酶(LPOR)合成叶绿素,保证正常生长。

杜氏盐藻因此选用chlN基因及其上下游序列共4.0kb为同源片段,以氯霉素乙酰转移酶基因cat和除草剂草丁膦(PPT)抗性基因bar为选择标记,以aptA基因的启动子和rbcL基因的终止子为调控元件,构建杜氏盐藻叶绿体转化载体pchlN-CAT-BAR,用基因枪法在100psi氦气压力下轰击野生型盐藻,将含两个外源选择标记基因的质粒载体转入其中,使载体在盐藻叶绿体内发生同源置换将外源基因定点整合入叶绿体基因组chlN位点。

此前,用离心稀释法和抗生素筛选法制备无菌盐藻用于转化,确保原有藻种中存在的细菌不影响转化和筛选的顺利进行,同时依本实验室无菌杜氏盐藻自身情况确定抗生素筛选浓度。以cat基因作为主要筛选标记基因,bar基因作辅助筛选标记基因,用氯霉素、PPT筛选转化藻株。筛选的转化藻株经氮气高压细胞破碎仪破碎,超速蔗糖密度梯度离心法提取完整叶绿体,又经SDS碱裂解法裂解叶绿体提取转化藻叶绿体基因组,设计特异性引物PCR扩增鉴定cat基因及bar基因转化整合情况。

结果发现在氯霉素浓度为200μg/ml的选择压力下,野生型盐藻12天左右死亡,转化藻仍正常生长,再经4μg/mlPPT继代筛选,得到稳定的盐藻转化株,经PCR扩增鉴定,cat基因及bar基因已经整合入盐藻叶绿体。由此可得以chlN基因作为同源片段,cat基因和bar基因作为选择标记基因构建盐藻叶绿体转化载体是可行的,为日后以chlN基因作为同源片段在盐藻叶绿体内表达外源蛋白提供先决条件。