杜氏盐藻（Dunaliellasalina）叶绿体转化研究

近些年来，人们在转基因植物方面进行了大量的研究。与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比，转基因植物不需要昂贵的设备和严格的培养条件，具有光合自养、成本较低，植物病毒不感染人类等优点，已成为一类比较廉价和安全的生物反应器。

然而高等植物培养周期过长，生长受季节性限制，因此许多研究兴趣集中到生长迅速，培养易的单细胞绿藻上。

杜氏盐藻属绿藻门绿藻纲团藻目，除缺乏细胞壁外，其形态和结构特征与衣藻十分相似，是一种原生质裸露的嗜盐性浮游单细胞藻，长约6-15μm，呈椭圆形或梨形，有双鞭毛，能在水中游动。

有一个大型杯状叶绿体约占细胞体积的48％左右。该藻的突出优点在于抗逆性极佳，可在0.05M-5M的盐水中生长，最佳生长繁殖盐度为2-3M，是目前已知最耐盐的真核生物。由于杜氏盐藻可在高渗盐溶液中生长，这是许多其它生物难以生存的环境，故其大规模培养不需昂贵的发酵罐或其他培养装置，可以直接采用开放式培养，大大降低生产成本。

因此，杜氏盐藻是生产药用蛋白的良好宿主。植物的细胞核转化技术已发展成熟并得到广泛应用，但核基因组的遗传转化仍存在一系列至今尚未解决的问题：例如由于核基因组大，背景复杂，外源基因的整合位点和整合的拷贝数难以人为控制，造成郑州大学2003年博士学位论文杜氏盐藻(Dunaliellasalina)叶绿体转化研究外源基因表达效率低，容易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象;同时转入多个基因时操作步骤过于复杂，所表达的原核基因必须经过修饰改造，环境安全难以保证等。

叶绿体转化系统的出现为克服这些困难带来了希望。与核转化相比，叶绿体基因组小，遗传操作简单，外源基因是通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组。定点整合有利于人为控制外源基因的插入位点，可以将目的基因定位在适于表达的位点，能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等类的基因沉默问题。由于叶绿体中DNA分子有多个拷贝，同时叶绿体对表达产物的积累有较强的承受能力，保障了外源基因在叶绿体中的高效表达。

另外，由于叶绿体基因组的原核性质，对来自原核生物的外源基因无需改造就可以在叶绿体内高效表达，而且可以将多个外源基因采取“多顺反子”的原核表达形式同时引入，并由共同的启动子控制，既方便操作又可避免由于存在多个相同启动子所带来的“共沉默”。这是核基因转化无法做到的。为建立杜氏盐藻叶绿体转化体系，我们研究了杜氏盐藻对7种基因工程研究中常用的抗生素及除草剂的敏感性;利用绿色荧光蛋白(E血anced盯eennuoreseentprotein，EJP)为报告基因，验证了莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性，并构建载体转化盐藻，初步建立了杜氏盐藻叶绿体转化体系，为今后转基因盐藻生物反应器的建立和应用打下基础。

方法:根据杜氏盐藻的近缘藻类的叶绿体基因组序列资料，在基因编码区的高度保守区域设计引物，克隆了杜氏盐藻叶绿体165识NA基因、咖L基因和ch】N基因，并分别以165识NA基因和chlN基因序列为同源片段，以CAT和bar基因为筛选标记基因构建了三套杜氏盐藻叶绿体转化载体:2郑州大学2003年博士学位论文杜氏盐藻(D~Iiellasalina)叶绿体转化研究pDS165一eAf、pTN1269一bar和psp72一5一bar一3，用基因枪法转化杜氏盐藻，初步建立起杜氏盐藻叶绿体转化体系。

结果:1.研究了杜氏盐藻对氯霉素、新霉素、链霉素、卡那霉素、G418、壮观霉素和除草剂草丁嶙(Phosphinotricin，PPT)等7种基因工程研究中常用的抗生素及除草剂的敏感性。实验结果表明，杜氏盐藻对卡那霉素、新霉素、G418和链霉素极不敏感，当这些抗生素用量高达600p创ml时，仍不能抑制杜氏盐藻的生长;壮观霉素对杜氏盐藻的生长有一定抑制作用，但用量较高，浓度为200、岁ml以上才能明显抑制杜氏盐藻的生长，并且即使用量高达600p留ml时仍不能完全杀死杜氏盐藻;杜氏盐藻对氯霉素敏感，50协留ml的氯霉素即可明显抑制杜氏盐藻的生长;100协留ml的氯霉素可杀死杜氏盐藻，200协留ml以上的氯霉素经10天左右即可杀死杜氏盐藻。此外，杜氏盐藻对除草剂草丁磷高度敏感，当培养液中草丁嶙浓度为1协留ml时，杜氏盐藻的生长就受到明显的抑制;草丁嶙浓度达到4协留ml时，培养3至5天即可明显观察到杜氏盐藻细胞的白化和死亡。

2.莱茵衣藻叶绿体吻A启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性我们选取绿色荧光蛋白为报告基因，将报告基因插入殉A启动子与rbcL终止子之间，构建了质粒pSP71一atPA一EGFP，通过基因枪法转入杜氏盐藻，在荧光显微镜下观察到EGFP基因在杜氏盐藻叶绿体中得到了表达。

3.杜氏盐藻叶绿体165出NA基因的克隆和转化载体的构建根据杜氏盐藻的近缘藻类的叶绿体基因组序列资料，克隆了杜氏盐藻叶绿体16SrRNA基因部分序列1100bp。