杜氏盐藻GFP表达载体的构建及电转化

本实验扩增了RR-gfp和gfp片段,并分别与含有盐藻强启动子的载体连接,构建了2种带有gfp报告基因的新型质粒表达载体p215t和p115t,质粒酶切电泳结果从分子水平证明载体构建成功。

质粒载体转化EscherichiacoliMC4100A细胞,探讨了外源基因gfp在原核宿主中的表达。用p215t和p115t分别转化大肠杆菌,gfp基因在原核宿主中实现了表达,但荧光蛋白产物在宿主细胞中的分布有所不同。用p215t转化细菌细胞,转化子荧光在细胞周围形成一个光圈或分布在两极。在p215t中,gfp基因上游存在RR-信号肽序列,信号肽介导荧光蛋白在细胞内发生了转运。p115t中不存在信号肽序列,荧光均匀分布于转化细胞。

本实验采用电击法将质粒载体转化Dunaliellasalina细胞,对藻龄、电击缓冲液以及电场强度3种电转参数分别进行了探讨,确定了本实验条件下的最佳转化条件。实验证明,选择藻龄为7d的细胞,电击缓冲液组分为1.0mmol·L-1HEPES+0.5mol·L-1甘油,电场强度为6kV·cm-1进行转化可获得本实验条件下最佳转化效果,载体p215t和p115t的最高转化率分别为1.00‰和1.02‰。

由于缺乏细胞壁,盐藻细胞对于渗透压十分敏感。在电击转化过程中,维持细胞渗透压是提高转化效率的有效方法。本实验通过添加甘油改进电击缓冲液成分,讨论了甘油对于提高转化前细胞存活率的作用,同时研究了不同浓度甘油对于盐藻细胞生长的影响。实验证明,用含有0.5mol·L-1甘油的HEPES缓冲液处理转化前细胞可获得最高存活率,约86%。当甘油被添加到盐藻培养基时,实验发现低浓度甘油能够促进细胞恢复生长,高浓度甘油对于细胞生长具有毒害作用;培养基中含有5mmol·L-1甘油对于维持细胞生活力、促进总生物量的积累具有最佳效果。

电击转化效果和甘油生理实验均表明,0.5mol·L-1甘油可作为盐藻电击转化过程中一种良好的稳渗剂。用质粒载体p215t和p115t分别转化杜氏盐藻细胞,报告基因gfp均能成功在藻细胞中实现表达,gfp将成为盐藻基因工程中一种良好的筛选标记。镜检结果显示,用p115t转化盐藻细胞,转化子荧光亮度更高,且均匀分布;用p215t转化盐藻细胞,转化子荧光亮度稍低,少数细胞的形态和荧光均出现异常现象,初步推断可能与RR-信号肽有关。

本实验所得结果将为建立新型杜氏盐藻生物反应器提供了良好的实验参数,有助于推动盐藻转基因研究。