利用ITS序列对两个盐藻株的分子鉴定

利用ITS序列对两个盐藻株的分子鉴定

JOURNALOF SHANGHAI UNIVERSITY(NATURALSCIENCE)Vol.12 No.1Feb.2006

收稿日期:2005-01-24　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070392)

通信作者:宋任涛(1970～),男,教授,博士,研究方向为植物分子生物学与功能基因组学.E-mail:rentaosong@staff.shu.edu.cn

文章编号:1007-2861(2006)01-0084-05

关键词:盐藻;ITS序列;系统发育树

中图分类号:Q 7　　　文献标识码:A

盐藻是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻,是已知最耐盐的真核生物之一,可在接近淡水(NaCl<50

mmol L)直至饱和盐水(NaCl>5 mol L)的环境中存活,最适合的生长盐浓度为1.5～2.0 mol LNaCl[1];与其它绿藻相比,盐藻缺乏稳固的细胞壁,细胞被薄且有弹性的质膜包围,这是盐藻被用作研究生物渗透调节的模式生物的一个主要原因.有些盐藻在高盐、高光照的培养条件下,积累大量的β-胡萝卜素使细胞变成橙红色,因此,盐藻可以作为一个极好的模型来研究光合生物类胡萝卜素的合成及调控[2～5].如今盐藻已经作为市场上天然β-胡萝卜素的主要来源,主要应用于食品、医药、化妆品等行业.

本实验室长期从事盐藻的分子生物学研究,在长期的研究过程中发现本实验室的两株盐藻(暂命名为Dunaliella salinaSHU 01 andDunaliella salinaSHU02)在正常盐浓度的培养条件下,DunaliellasalinaSHU 01细胞较小,在培养的过程中营养细胞一直为绿色,这与Dunalilla salina的典型生理特征有很大的差别;而Dunaliella salinaSHU02的细胞较

大,在高盐、高光强、营养缺乏的培养条件下细胞内积累大量的β-胡萝卜素,使细胞呈现出明显的橙红色(如图1),这与Dunaliella salina的典型生理特征比较接近,因此我们断定这两株盐藻可能属于不同的种类.而以前我们是把Dunaliella salinaSHU01当成Dunaliella salina来进行研究的,文献[6～8]也是以Dunaliella salina的名义发表的.为了以后进一步从事盐藻的分子生物学研究,非常有必要对这两株不同盐藻进行鉴定.

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　本实验所用的盐藻

Dunaliella salinaSHU 01由中科院上海植物生理生态研究所焦新之先生惠赠,Dunaliella salinaSHU02由徐州师范大学华勇先生惠赠.

1.1.2　工程菌和克隆用载体

克隆用的宿主菌为大肠杆菌DH5α,克隆用载体为PMD18-Tvector,购自TaKaRa公司.

1.1.3　实验用试剂盒、工具酶和其它试剂Taq酶等PCR试剂购自上海生工公司,PCR产物胶回收试剂盒购自博大泰克公司.

1.1.4　引物和测序

实验中所用引物的合成以及克隆的测序均由上海博亚生物公司完成.

1.2　方法

1.2.1　盐藻基因组DNA的提取及纯化

盐藻基因组DNA的提取及纯化见文献.

1.2.2　引物设计

根据GenBank中Dunaliella salina的18S rDNA基因序列(M84320)以及Dunaliella parva的28S rDNA基因序列(AF183473),用Blastn软件于GenBank数据库中搜索同源序列.根据搜索结果,选择最保守的区域进行引物设计,引物示意图及序列见图2.

1.2.3　PCR扩增及克隆

分别以两株盐藻基因组DNA为模板,引物为ITSF和ITSR进行PCR扩增,目的片段用胶回收试剂盒回收纯化.纯化的片段连接到PMD18-T vector上,转化大肠杆菌DH5α.

1.2.4　序列测定及分析

阳性克隆经过鉴定后在上海博亚生物公司通过双脱氧荧光标记进行测序.测序结果用vectorNTI软

件进行分析.

1.2.5　系统发育树的构建

分析盐藻的ITS全序列(ITS-1+ITS-2),利用ITS序列对两个盐藻株的分子鉴定

简约法(maximum parsimony,MP)和邻接法(neighbor-join,NJ)构件系统发育树,并以bootstrap作可信度分析[11],系统发育树的构建以衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)为外群.