杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的克隆及功能研究

RbcS (the small subunits of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)基因是编码1,5-二磷酸核酮糖羧化／加氧酶(Rubisco)小亚基的基因。这种酶是叶绿体内含量最高的一种蛋白,位于叶绿体基质内,能催化光合作用中固定CO2的反应,其小亚基RbcS对全酶Rubisco的结构和功能起调控作用,且常以基因家族的形式定位于一条或多条染色体上,大多数高等植物中包含4～10个RbcS基因,各基因表达的氨基酸序列有差异,但是蛋白质在功能上基本是相似的。

高等植物中的RbcS基因家族各成员在植物的各个器官及发育的各个时期的表达情况不完全一样,所受的调控机制也不同,这种表达调控上的不同在转录水平和转录后水平都存在,各个基因在DNA-蛋白质结合和mRNA稳定性方面都存在差异,也就是说以基因家族的形式存在不是单纯地为了增加基因产物的表达。 盐分是影响植物发育增殖的一个重要因素,高盐下,在多数植物以及蓝藻中,盐胁迫是抑制光合作用的,但盐藻却能增强光合作用,Liska等的研究表明当盐藻从低盐环境转移到高盐环境时,它能通过增强光合作用,增加C02的同化,从而产生大量甘油,达到适应高盐环境的目的。其中RbcS在C02的同化及淀粉合成方面发挥重要作用,但是盐藻的RbcS在盐分胁迫下的表达调控机制研究不多。

本研究根据RbcS高度保守的氨基酸序列设计简并引物,采用RACE法扩增其5’和3’上下游未知序列,得到RbcS2新序列。再根据全长cDNA设计特异引物,利用荧光定量PCR方法分析光照和盐分对其表达的影响,这些为下一步研究RbcS基因家族中各成员的结构和功能,以及为探索盐胁迫下盐藻耐盐的分子机制提供实验依据。

实验方法 1简并引物扩增杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的部分cDNA序列 根据GenBank上登录的杜氏盐藻、莱茵衣藻、红球藻、团藻等藻类的RbcS基因高度保守的氨基酸序列设计简并引物。采用TRIzol试剂提取杜氏盐藻细胞总RNA,用M-MuLV反转录酶合成cDNA第一链为模板,PCR扩增RbcS基因的部分cDNA片段,产物用T-A法亚克隆到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序,结果与GenBank上其他物种的RbcS基因比对分析。

2 RACE扩增杜氏盐藻RbcS2上下游序列 根据上述扩增出的RbcS2部分cDNA序列设计特异引物,以5’和3’RACE法扩增上下游未知序列,PCR产物用T-A法亚克隆到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序 3杜氏盐藻RbcS2全长cDNA的拼接和分析 将扩增出的简并cDNA,5’和3’RACE cDNA进行拼接,到cDNA全长序列,并利用DNAMEN和GenBank BLAST分析核苷酸和氨基酸的同源性及密码子偏好性。

4杜氏盐藻RbcS2功能分析 根据已克隆到的杜氏盐藻RbcS2的cDNA设计特异引物,以已知的杜氏盐藻保守基因GAPDH为内参照,Trizol试剂分别提取光照下和不同盐度下,不同时间培养的盐藻总RNA,反转录成cDNA,利用荧光定量PCR分析其光照和耐盐功能。

实验结果 1简并引物扩增杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的部分cDNA序列 测序结果表明,简并引物扩增得到的部分cDNA片段长为209 bp,其氨基酸序列为69个氨基酸。BLAST结果表明,与GenBank中其他物种的RbcS有很高的同源性,且与杜氏盐藻RbcS1氨基酸的同源性为84%,说明所得的序列是杜氏盐藻RbcS的一个新片段。 2 RACE扩增杜氏盐藻RbcS2上下游序列 5’RACE得到一个有302个核苷酸的序列,除去部分已知序列及非编码区序列,共得到一个有168未知核苷酸的序列,由其推导的氨基酸序列有56个氨基酸残基,5’UTR部分有90个核苷酸。3’RACE得到一个有489个核苷酸的序列,除去部分已知序列及非编码区序列,共得到一个有271未知核苷酸的序列,由其推导的氨基酸序列有90个氨基酸残基,3’UTR部分有218个核苷酸。

3杜氏盐藻RbcS2全长cDNA的拼接和分析 将简并引物、5’RACE、3’RACE扩增得到的三段cDNA序列拼接起来,得到的cDNA全长为869 bp,包含561 bp的开放读码框,推导成多肽链包含187个氨基酸,BLAST结果显示,RbcS2的氨基酸序列与其他物种的RbcS的氨基酸序列有很高的同源性,且与杜氏盐藻的RbcS1(GenBank登录号AY739272)进行同源性分析,核苷酸和氨基酸序列的相似性分别为77.89%和77.19%,说明所得的序列是杜氏盐藻RbcS的一个新的片段,克隆得到了完整的杜氏盐藻RbcS基因家族的一个新成员RbcS2基因的cDNA序列,且与其它微藻的氨基酸序列同源性高些,与高等植物的氨基酸序列同源性低。对该基因密码子的使用偏好性进行分析,具有两种以上同义密码子的氨基酸偏好使用以C／G为结尾的密码子,表明杜氏盐藻和其他真核生物一样一般偏爱以C／G结尾的密码子。

4杜氏盐藻RbcS2功能分析 在黑暗条件下,RbcS2的表达量相对较低,RbcS2对光照的反应随时间推移,其转录表达先快速上升,达到平台期后逐步下降并趋于稳定,光照能强烈诱导该基因的表达,并具有时间效应。高盐下,RbcS2基因的转录表达高于正常水平,又由于有光照的影响,二者均随光暗有表达起伏变化。 结论与讨论 盐胁迫下,多数植物的光和作用都是受到抑制的,但盐藻却能增强光合作用。为分析盐藻高盐下促进光合作用独特的盐耐受性能,本研究从光合作用中固定CO2的关键基因RbcS入手,克隆到其基因家族中的一个新序列RbcS2的cDNA全长,并以此设计一对特异引物,利用相对荧光定量PCR分析其光照和耐盐功能。结果表明,与暗环境相比,光照能在一定时间内诱导RbcS2基因的转录表达；在高盐胁迫条件下,RbcS2的转录高于正常水平。高盐下,盐藻RbcS2的升高说明其可能是一个与盐胁迫相关的基因；这些结果为从分子水平上研究高盐下,盐藻的光合作用不是降低而是加强提供一些实验依据,及为高盐下盐藻分子水平的耐盐机制奠定基础。

【关键词】：杜氏盐藻 RbcS基因 RACE 耐盐 荧光定量PCR