核基质附着区(matrix attachment regions，MARs)又被称作核骨架附着区(scaffold attachment regions，SARs)，是染色质被限制性酶消化后仍然结合在核基质上的DNA序列。目前还没有发现MARs序列具有保守的一致序列，但是它们之间具有一些共有模体，如：A-box、T-box、酵母自主复制序列、果蝇拓扑异构酶Ⅱ识别位点、弯曲DNA等。近年来的研究发现，MARs能够提高外源基因表达，降低转基因沉默，同时还能使染色质形成环状结构，也可以作为DNA复制的起始点或者调控基因的转录，目前关于MARs的调控机制仍然不清楚。
真核生物基因的表达调控主要是顺式作用DNA元件与反式作用蛋白因子的相互作用实现的，因此要研究某一顺式作用元件的调控机制，必须首先分离与其相互作用的反式作用蛋白因子并研究其功能。能有与MARs序列相结合的蛋白被称作MAR结合蛋白(MAR-binding proteins，MARBPs)，目前，已经有少量MAR相关的蛋白被克隆出来，但是尚未见到有关单细胞藻类杜氏盐藻MAR结合蛋白的报道。
杜氏盐藻(Dunalilla salina)是一种简单的单细胞真核绿藻，没有细胞壁，是一种抗逆性极强的生物，能在NaCl浓度为0.05～5M的培养液中生存。杜氏盐藻为单细胞藻类，没有组织和器官上的特异分化，因此以它为研究材料来研究MARs调控机制有独特的优势。前期工作中，我们构建了杜氏盐藻MAR序列文库，分离出了3个强MAR序列，克隆出一个MAR结合蛋白基因，基因全长1623bp，编码541个氨基酸(GenBank accession no：DQ=1124215，AAZ31075)。为研究MAR结合蛋白的相关功能，本研究根据GenBank上登录的序列设计特异引物，克隆杜氏盐藻MARBP基因全长，构建原核表达载体，转入大肠杆菌工程菌BL21(DE3)中表达MARs序列结合蛋白，最后利用凝胶滞留试验体外验证它和MARs序列的结合能力。这将为进一步探讨其在体内的生物功能提供可靠的实验依据，同时为研究MARs调控机制奠定基础。
一、杜氏盐藻MARBP基因的克隆及序列分析 1方法 1．1杜氏盐藻总RNA的提取 采用TRIzol试剂从生长至对数期的杜氏盐藻细胞中提取盐藻总RNA。 1．2杜氏盐藻MARBP基因全长的克隆及序列分析 根据GenBank上登录的MARBP的cDNA全长设计引物。以杜氏盐藻总RNA为模板，用AMV反转录酶合成cDNA第一链，并以合成的cDNA第一链为模板进行PCR扩增杜氏盐藻MARBP基因的序列全长。PCR产物连接T载体上，测序。测序正确的质粒命名为pMD-MBP。测序结果与GenBank上的MARBP基因序列进行比对分析，并BLAST进行同源性分析。
2结果 2．1杜氏盐藻总RNA的制备 提取的总RNA OD_(260)/OD_(280)在1.8-2.0之间，OD_(260)/OD_(230)大于2.0，说明纯度较高；1％琼脂糖电泳可见28s和18s两条清晰的rRNA条带，且18s与28s rRNA荧光强度比值约为1：2，表明RNA保持较好的分子完整性。 2．2杜氏盐藻MARBP基因全长的克隆及序列分析 测序分析表明，所克隆序列长1623 bp，编码541个氨基酸；BLAST结果显示，该序列与GenBank上登录的杜氏盐藻MARBP的cDNA序列具有99％的同源性，而所编码氨基酸序列之间存在一个氨基酸残基的差异。表明所克隆的序列确实是杜氏盐藻MARBP基因的cDNA序列。
二、杜氏盐藻MARs序列结合蛋白原核表达载体的构建及表达
1方法 1．1杜氏盐藻原核表达载体的构建 EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切质粒pMD-MBP，胶回收并纯化MARBP cDNA片段，同样对pET-28a(+)载体进行EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切，纯化回收线性载体片段后，用T_4DNA连接酶连接目的基因片段和线状载体，构建杜氏盐藻MARs序列结合蛋白原核表达载体pET-MBP。载体转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，小量提取质粒，用EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切鉴定，测序确定读码框是否正确。
1．2杜氏盐藻MARs序列结合蛋白在大肠杆菌中的表达 将经鉴定读码框正确的重组原核表达载体pET-MBP转化大肠杆菌工程菌株BL21，挑选阳性菌落，接种到5mL卡那霉素浓度为50mg/L的LB培养基中，37℃振荡培养12h，按照1：100的比例接种到新的卡那霉素浓度为50mg/L的LB培养基中，37℃震荡培养至OD_(600)为0.4-0.6之间，加入IPTG使其终浓度为0.2 mM，继续培养并分别于1，2，4，6，8 h，离心收集菌体1 ml，加入100μl 1×凝胶上样缓冲液，100℃水浴煮沸3 min，10％SDS-PAGE电泳检测重组蛋白表达情况。
1．3 Western blotting鉴定重组杜氏盐藻MARs序列结合蛋白的表达 pET28a(+)原核表达系统产生的融合蛋白，其N端均携带6×组氨酸标签(6×His tag)，利用抗6×his tag抗体(北京普利莱基因技术有限公司)为一抗和山羊抗小鼠IgG (北京中山生物技术有限公司)为二抗，对表达的重组蛋白进行Western blotting分析，检测重组蛋白在BL21中表达情况。
2结果 2．1杜氏盐藻原核表达载体的构建 将杜氏盐藻MARs序列结合蛋白定向克隆于原核表达载体pET28a(+)中，双酶切鉴定以及序列测定结果表明，基因插入方向正确，没有发生读码框易位，原核表达载体pET-MBP构建成功。
2．2杜氏盐藻MARs序列结合蛋白在大肠杆菌中的表达 pET-MBP转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导重组融合蛋白表达，SDA-PAGE结果显示重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效的表达，融合蛋白分子量大小约为75KD。
2．3 Western blotting鉴定重组杜氏盐藻MARs序列结合蛋白的表达 用6×抗his tag的抗体作为一抗，用山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗做Western blotting分析。结果显示在75KD处有特异条带，证明含有6×his tag的融合蛋白已经表达。
三、杜氏盐藻MARs结合蛋白的纯化及功能分析 1方法 1．1重组蛋白的纯化 离心收集经IPTG诱导培养的细菌，用蛋白纯化试剂盒中的结合缓冲液重悬菌体，高压细胞破碎仪破碎细胞，1.5×10~5 kPa的压力条件下持续1h。之后10000rpm离心15min分离上清和沉淀。按照试剂盒说明书操作纯化蛋白。 1．2生物素3′末端标记探针 用生物素3′末端标记试剂盒(PIERCE)，标记已分离的MARs序列和由上海生工合成的DNA序列，作为探针，并检测探针标记效率。 1．3凝胶滞留试验(Electrophoretic Mobility Shift Assays，EMSA) 凝胶滞留试验可以检测DNA与其特异性结合蛋白相结合状态。
利用以上步骤的纯化后的融合蛋白和标记好的探针，使蛋白质和DNA发生特异性结合，在非变性的聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，检测其迁移率的变化。 2结果 2．1重组蛋白的纯化 重组蛋白经Ni-NTA spin column亲和层析柱纯化之后，用Strip Buffer洗脱之后可以得到较高纯度的蛋白，电泳结果显示，纯化后蛋白约占总蛋白含量的70％。
2．4生物素3′末端标记探针 探针标记效率良好，可供以下试验使用。 2．5凝胶滞留试验 凝胶滞留试验结果表明，在大肠杆菌BL21中表达的杜氏盐藻MARs序列结合蛋白并不能与标记的探针发生特异性的结合。
四、结论 1．本研究成功克隆了杜氏盐藻MARs序列结合蛋白基因cDNA序列编码区，全长为1623 bp，编码541个氨基酸。通过BLAST分析可知，该基因与GenBank上登录的序列具有99％的同源性，与其他物种的MARs序列结合蛋白也具有较高的同源性。
2．构建了杜氏盐藻MARs序列结合蛋白原核表达载体，并在大肠杆菌BL21中成功表达外源融合蛋白质，融合蛋白大小约为75 KD。
【关键词】：杜氏盐藻 核基质附着区 MARs序列结合蛋白 原核表达
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