杜氏盐藻FKBP18基因的克隆及其功能分析

FKBP18属于FK506结合蛋白家族(FK506bindingproteins,FKBPs),是免疫抑制剂FK506以及雷帕霉素(rapamycin,RPM)的一类药物受体蛋白。FK506,又称他克莫司(tacrolimus).是一种大环内酯类抗生素,从streptornycestsukubaensis属中分离出来。临床上主要应用于肝移植,在肾移植及其他器官移植的应用也有报道。它能抑制多种细胞因子如白细胞介素-2、γ干扰素的产生,阻断T细胞活化,且抑制细胞毒性T细胞的增殖和白细胞介素-2受体的表达。雷帕霉素也是一种大环内酯类免疫抑制剂,通过不同的细胞因子受体阻断信号传导,阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程,从而发挥免疫抑制效应。

FKBPs是一个在各种原核生物和真核生物中广泛存在的蛋白家族,参与多种生命活动。如有些FKBPs可以调节激素信号转导通路,从而调节种子的萌发,植株的生长等过程,还发现有一些FKBPs在非生物胁迫以及植物抗逆性中也发挥了重要的作用。FKBP18是本实验室以杜氏盐藻(Dunaliellasalina)类驱动蛋白钙调素结合蛋白(kinesinlikecalmodulin-bindingprotein,KCBP)N端(结合货物结构域)为诱饵筛选鞭毛再生酵母双杂交cDNA文库所得到的阳性克隆,并已通过回交实验验证了FKBP18和KCBP拘相互作用。DsKCBP属于驱动蛋白-14家族的一个成员,是在驱动蛋白和类驱动蛋白中唯一的一个在邻近它的马达结构域处有一个钙调素结合结构域的蛋白,也是有关鞭毛的重要的蛋白。

研究显示莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的KCBP参与鞭毛功能和细胞分裂,而其作用机制尚不清楚,FKBP18是否参与鞭毛功能也尚未见报道。鞭毛/纤毛是一种由细胞质膜延伸的细胞表面突起,主要由微管组成,纤毛蛋白的突变可导致发育缺陷,如多趾畸形、视网膜变性和多囊肾等。所以目前对病理方面和影响植物体生长中FKBPs的研究已成为热点且文献很多,但关于FKBP与鞭毛/纤毛的联系还不清楚。杜氏盐藻是一种极度耐盐的单细胞双鞭毛真核绿藻,以其无细胞壁、有一对等长的鞭毛、生长周期短、培养条件简单等独特的优势可作为研究鞭毛的有力工具。本研究首先根据已知的杜氏盐藻FKBP18cDNA3’端序列,利用5’RACE方法扩增得到FKBP18cDNA5’端序列进而得到其全长。为研究杜氏盐藻FKBP18与鞭毛的潜在联系,分别提取秋水仙碱处理下、鞭毛再生状态下和热处理情况下杜氏盐藻的总RNA并反转录成cDNA,通过实时荧光定量PCR方法分析FKBP18在杜氏盐藻鞭毛被秋水仙碱破坏、鞭毛再生以及高温时的作用。

杜氏盐藻KCBP有三个独立的结构域：一个肌球蛋白尾同系物区域4(MyTH4);一个类-踝蛋白结构域(B4.1)；一个钙调素结合结构域(CBD)。为更深入研究杜氏盐藻FKBP18与鞭毛的联系,本研究还分别设计引物扩增得到DsKCBPN端的MyTH4和B4.1两个结构域的基因序列,通过酵母双杂交的方法验证杜氏盐藻FKBP18与KCBP的可能作用位点。序列分析显示克隆得到的杜氏盐藻FKBP18基因开放阅读框全长序列为762bp,编码253个氨基酸,相对分子质量为27.037kD,等电点为8.6,同源性分析结果表明克隆所得序列确为杜氏盐藻FKBP18基因序列。实时荧光定量PCR结果显示,分别进行秋水仙碱破坏和热处理下,DsFKBP18mRNA水平都呈现升高的趋势,而鞭毛再生过程中DsFKBP18mRNA水平与其生长速率具有明显的一致性,明确表明杜氏盐藻FKBP18不仅参与杜氏盐藻鞭毛解组装的过程,与杜氏盐藻的耐高温调控有潜在的联系,还与鞭毛再生过程密切相关,暗示FKBP18可能参与了杜氏盐藻细胞通过鞭毛对外界应激反应的应答。

另外,酵母双杂交结果显示,DsFKBP18与DsKCBP的N端MyTH4(?)B4.1都有相互作用,可能与这两个结构域共同作用发挥功能,也不排除酵母双杂交方法存在的假阳性,还有待进一步验证。本研究成功克隆了杜氏盐藻FKBP18基因序列并对其功能进行了初步研究,证明该基因不仅参与了杜氏盐藻鞭毛解组装和再生,而且参与了对外界高温的应激反应。

【关键词】：杜氏盐藻 FKBP18 基因克隆 鞭毛/纤毛 酵母双杂交