杜氏盐藻寡糖基转移酶亚基STT3a的基因克隆与功能分析

N-连接糖基化是真核生物细胞中最常见的蛋白质修饰,这个过程是由位于糙面内质网膜上的寡糖基转移酶(OST)催化的。Stt3p为OST的催化亚基,它在已知的OST亚基中是最保守的。研究发现酵母的Stt3p编码一个78kDa的蛋白,并且几乎所有的真核生物基因组中都存在编码酵母Stt3p蛋白的同系物。哺乳动物的基因组编码酵母Stt3p的两种同系物STT3a和STT3b,它们的表达具有组织特异性差异,并能调节OST的活性,且含有一个STT3a亚基的OST比含有STT3b亚基的OST对于选择完全装配的长链寡糖供体(Glac3Man9GlcNAc2-PP-Dol)更具有特异性。

最近的研究发现拟南芥OST的STT3a亚基作为一种跨膜蛋白在高盐应激反应中发挥一定作用。杜氏盐藻(Dunaliellasalina,D.salina)是一种高度耐盐的单细胞双鞭毛真核绿藻,它没有细胞壁,能够在0.5-5mol/LNaCl盐浓度下生存,具有很强的渗透调节能力。近年来,虽然人们围绕盐藻的耐盐机制进行了大量的研究,但是目前对其耐盐机制还不是十分清楚。

另外,我们前期的研究发现：在高盐条件下,盐藻的运动性明显降低,而作为盐藻运动器官的鞭毛直接参与了盐藻的运动。为了解跨膜蛋白STT3a在盐诱导反应中的作用及盐藻的盐耐受性和鞭毛介导的运动性之间是否有潜在的联系,本研究根据衣藻、拟南芥等STT3a蛋白的氨基酸高度保守序列VCVFTA、DVDYVL设计一对简并引物,采用RT-PCR及RACE的方法扩增获得杜氏盐藻STT3a基因全长的cDNA序列。然后将杜氏盐藻STT3a的cDNA全长序列定向克隆于原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,利用SDS-PAGE方法,分析STT3a融合蛋白在大肠杆菌BL21中的表达情况。并通过PrimerPremier5.0在STT3a结构域中设计一对特异性引物,分别提取不同盐浓度培养条件及鞭毛再生状态下的杜氏盐藻cDNA,通过实时荧光定量PCR分析STT3a在杜氏盐藻盐诱导及鞭毛再生过程中的作用。

另外,运用改进的银染法对杜氏盐藻鞭毛及藻体进行银染,并根据公式V=(S2—S1)/t(其中V为相对生长速率,S2和S1分别为相邻两个时间点的鞭毛长度平均值,t代表间隔时间),最终求出杜氏盐藻鞭毛再生不同时期的相对生长速率。序列分析显示克隆得到的杜氏盐藻STT3a基因cDNA全长序列为2574bp,包括114bp的5’UTR、279bp的3’UTR以及2181bp的开放阅读框(openreadingframe,ORF),编码727个氨基酸残基,其蛋白质的理论等电点为9.11,分子量为80.25kDa。对所得氨基酸序列进行同源性分析,BLAST结果显示,克隆所得的序列为杜氏盐藻STT3a蛋白的基因序列。SDS-PAGE结果显示：在80kDa左右出现一条特异性条带,与预测的蛋白分子量大小一致。

实时荧光定量PCR结果显示杜氏盐藻STT3amRNA水平随着盐浓度的升高而逐渐增加,其水平在3.5mol/LNaCl浓度时比在1.5mol/LNaCl浓度时升高了11倍(P＜0.01)。另外,与没有脱鞭毛的杜氏盐藻相比,STT3amRNA在鞭毛再生过程中持续高表达。杜氏盐藻鞭毛再生前15min鞭毛增长比较明显,至420min时基本上完成鞭毛再生。本研究显示杜氏盐藻STT3a基因的高表达在盐藻盐适应和鞭毛再生过程中发挥重要作用。

【关键词】：杜氏盐藻 STT3a基因 耐盐 鞭毛再生