杜氏盐藻GPI多克隆抗体的制备及其在MDCK细胞中的定位

葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphoisomerase)又称为磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucoseisomerase)简称GPI,是一种糖代谢途径中催化葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸之间相互转化的异构酶。GPI在所有真核生物及原核生物细胞中普遍存在、具有高度保守性,但是其功能多样,通常为同二聚体分子。在不同生物中,GPI的分子量存在差异,但是其功能区域相当保守,在不同生物中具有很高的同源性。

近年来的研究结果显示,GPI作为非常保守的异构酶,不仅参与糖代谢,而且还具有一特殊的功能,如在动物细胞中作为自分泌运动因子(AMF)促进肿瘤细胞移动、增殖和浸润；作为神经白细胞素(NLK),帮助培养的感觉神经元和特殊的胚胎脊髓神经元存活；作为一种成熟因子(MF)介导人类骨髓白血病HL-60细胞分化为终端单核细胞。

研究发现,K/B×NT细胞受体转基因小鼠中抗GPI自身抗体对小鼠的类风湿性关节炎的发展有关。人类GPI酶活性的遗传缺陷主要影响红细胞,引起遗传的非球形红细胞溶血性贫血(HNSHA)。杜氏盐藻(Dunaliellasalina)是一种极度耐盐的单细胞真核绿藻,没有细胞壁,属于绿藻门,绿藻纲,团藻目。杜氏盐藻具有双鞭毛,可以游动,细胞内具有一个杯状的叶绿体,具有极强的光合作用。

目前关于杜氏盐藻GPI(DsGPI)的研究仍是空白,而且没有针对DsGPI的商业化抗体出售,因此不能检测DsGPI在蛋白水平的表达情况。本研究根据我们在GenBank上登录的序列设计引物克隆了DsGPI基因cDNA的开放阅读框(ORF),构建了原核表达载体pET28a-DsGPI,诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经纯化获得了高纯度的DsGPI重组融合蛋白。

通过免疫新西兰白兔,制备了兔抗DsGPI的特异性多克隆抗体。并利用自制的多克隆抗体在蛋白水平检测了盐胁迫状态下DsGPI的表达变化,完成了自制兔抗DsGPI多克隆抗体在DsGPI生物学功能研究中的首次应用。为进一步研究DsGPI与人AMF的关系,本研究还构建了荧光定位载体pEGFP-C1-DsGPI,并将pEGFP-C1-DsGPI与pEGFP-C1-AMF转染狗肾上皮细胞MDCK,并在荧光显微镜下进行了亚细胞水平的定位。为进一步研究DsGPI与人AMF的功能相关性进行了探索。方法1DsGPIORF的克隆与序列分析根据Genbank登录的DsGPIcDNA序列(GenBank登录号：FJ210719)设计引物,以提取的杜氏盐藻总RNA为模板,RT-PCR扩增DsGPI的ORF全长并连接到pMD18-T载体上。

测序结果与GenBank上登陆的DsGPIcDNA序列进行比对。2DsGPI基因原核表达载体的构建将pMD18-DsGPI用NdeI和EcoRI双酶切后将目的基因定向插入到pET28a(+)中,构建原核表达载体pET28a-DsGPI并测序。3pET28a-DsGPI在工程茵BL21(DE3)中的诱导表达与纯化将测序正确的重组质粒pET28a-DsGPI转化感受态细菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE蛋白电泳,检测蛋白表达情况。优化表达条件后大量表达目标蛋白,收集包涵体沉淀,经洗涤溶解后用Ni2+-NTA纯化柱纯化DsGPI重组融合蛋白,并进行定量。

4DsGPI多克隆抗体的制备将纯化后的DsGPI蛋白与弗氏佐剂乳化后,皮下多点注射免疫新西兰白兔。每只的免疫蛋白量为1mg共免疫7次,末次免疫7天后颈动脉取血,间接ELISA法检测抗血清滴度,Westernblots检测抗体特异性。5在盐胁迫环境下检测DsGPI的表达将在正常UTEX培养基(1.5MNaCl)中生长的杜氏盐藻转入不同盐浓度的UTEX培养基(1.5M～3.5MNaCl)中进行盐胁迫状态下培养。在盐胁迫状态下培养16h后收集盐藻细胞,用盐藻蛋白提取液进行总蛋白的提取,并用自制兔抗DsGPI多克隆抗体按照Westernblots方法检测不同盐浓度胁迫状态下DsGPI蛋白的表达情况。

6DsGPI及人AMF在MDCK细胞中的定位以杜氏盐藻cDNA为模板,设计引物,扩增两端具有BamHI和EcoRI酶切位点的DsGPIORF序列,并定向插入荧光载体pEGFP-C1多克隆位点中。将狗肾上皮细胞株MDCK接种于6孔板中培养,按LipofectamineTM2000转染试剂说明书将真核定位载体pEGFP-C1-DsGPI和pEGFP-C1-AMF进行转染,同时以转染空载体pEGFP-C1的细胞作为阴性对照。pEGFP-C1-DsGPI和pEGFP-C1-AMF转染MDCK细胞24h后,用显微荧光摄像／照相系统观察EGFP-DsGPI和EGFP-AMF融合蛋白在MDCK细胞中的定位。

结果1DsGPIORF的克隆与序列分析用TRIzol试剂提取盐藻总RNA,提取的盐藻总RNA28S和18S条带清楚,纯度较高。利用RT-PCR法得到1980bp的DsGPIORF全长,该序列编码659个氨基酸。经BLAST分析,与GenBank上登录的DsGPI序列ORF具有100%的同源性。2DsGPI基因原核表达载体的构建NdeI和EcoRI双酶切重组质粒pET28a-DsGPI后得到约2000bp的条带,经测序鉴定该序列与GenBank已登录的DsGPIORF序列完全一致。

表明,原核表达载体pET28a-DsGPI构建成功。3pET28a-DsGPI在工程菌BL21(DE3)中的诱导表达与纯化IPTG诱导转化菌表达,SDS-PAGE结果显示在约78kDa处有一新的蛋白质条带,与DsGPI分子量大小一致,而对照菌株则没有相应蛋白的表达,证实DsGPI重组蛋白表达成功。包涵体蛋白经洗涤溶解后经Ni2+-NTA纯化柱纯化及SDS-PAGE分析,纯化后DsGPI蛋白的纯度达到96%。4DsGPI多克隆抗体的制备将纯化的DsGPI蛋白免疫新西兰白兔后,采用间接ELISA法测定抗血清效价。结果显示免疫7次后抗血清滴度为1：512000。Westernblots结果显示在约78kDa处有单一条带,表明DsGPI多克隆抗体制备成功。5在盐胁迫环境下检测DsGPI的表达SDS-PAGE分析可见,在DsGPI蛋白表达区(70kDa-80kDa)盐藻蛋白表达丰度相对稀少。

以制备的DsGPI多克隆抗体作为一抗进行Westernblots分析,结果显示随着盐胁迫浓度的升高,DsGPI的表达量也呈明显增加趋势,在蛋白水平验证了DsGPI是一种盐适应性蛋白。

6DsGPI及人AMF在MDCK细胞中的定位BamHI和EcoRI双酶切重组质粒pEGFP-C1-DsGPI后得到约2000bp的条带,经测序鉴定该序列与GenBank已登录DsGPIcDNA开放阅读框完全一致。将空质粒pEGFP-C1和重组质粒pEGFP-C1-DsGPI、pEGFP-C1-AMF转染狗肾上皮细胞MDCK,24h后在荧光显微镜下观察。转染空质粒pEGFP-C1的细胞,绿色荧光分布在整个细胞,而转染pEGFP-C1-DsGPI和pEGFP-C1-AMF重组质粒的细胞,绿色荧光在整个细胞都有分布,但在细胞核及其周围区域呈聚集现象。

结论:本研究成功克隆了杜氏盐藻GPI基因的ORF序列,构建了原核表达载体pET28a-DsGPI并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了大小约为78kDa的DsGPI融合蛋白。以纯度达到96%的DsGPI蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备得到了效价高达1：512000的兔抗DsGPI多克隆抗体,并证明具有较高特异性。以自制的DsGPI多克隆抗体为一抗,通过Westernblots检测了杜氏盐藻在盐胁迫环境下DsGPI的表达变化。

在蛋白水平证明了DsGPI是一种盐适应性蛋白,并且完成了自制DsGPI多克隆抗体的首次应用。通过融合绿色荧光蛋白的真核表达载体的转染,证明转入MDCK细胞的DsGPI-EGFP融合蛋白与人AMF在MDCK细胞中的定位具有明显相似性,为进一步研究DsGPI与人AMF的功能相关性进行了探索。

【关键词】：杜氏盐藻 GPI多克隆抗体 细胞定位