杜氏盐藻3-磷酸甘油脱氢酶基因的克隆、鉴定及表达纯化

杜氏盐藻作为一种植物和藻类耐盐机制研究的重要模式生物,是一种高度耐盐的单细胞绿藻。它之所以能耐受盐逆境与其细胞内具有一套独特的渗透压调节机制有关。

它能够在短时间内调节细胞体积的改变来平衡渗透压,之后通过甘油的合成与转化恢复细胞正常形态和大小。而NAD~+-3-磷酸甘油脱氢酶作为甘油合成中关键酶,对杜氏盐藻的耐盐调节起着重要的调控作用。

本实验中我们克隆了一种以NAD~+为辅酶的3-磷酸甘油脱氢酶,通过染色体步移PCR获得的3-磷酸甘油脱氢酶全长cDNA序列。并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,发现保守区域有NAD结合位点和3-磷酸甘油脱氢酶特征。从而在理论上证明了克隆到的cDNA即为以NAD~+为辅酶的3-磷酸甘油脱氢酶基因。同时构建了pET-32a-Gpdh表达载体,转化入宿主细胞大肠杆菌BL21/DE3中表达。

pET-32a-Gpdh载体的构建对于植物抗逆性工程菌起重要作用。重组质粒经温度和诱导剂浓度等表达条件的优化实现了蛋白的高效、可溶性表达,从而对3-磷酸甘油脱氢酶的性质进行了初步的研究。最终确定30℃、1.0mmol/LIPTG条件下,诱导工程菌株pET-32a-Gpdh-BL21,目的蛋白质重组杜氏盐藻3-磷酸甘油脱氢酶以可溶蛋白的形式存在于上清中。

进而采用两步镍柱亲和层析进行初步蛋白纯化,以便于进一步的生化试验、结构测定和功能研究。因此,本实验为解释杜氏盐藻在面临高渗胁迫下快速合成甘油的机制提供了帮助。对植物渗透压调节机理和耐盐育种研究具有重要的理论价值,并为植物抗逆育种开创了一条新的途径。

【关键词】：杜氏盐藻渗透调节3-磷酸甘油脱氢酶原核表达亲和层析

【学位授予单位】：华南理工大学