杜氏盐藻硝酸盐还原酶缺陷型突变株的功能互补分析

近年来，除了围绕盐藻的耐盐机制和光合作用机制进行了大量研究之外，转基因盐藻的研究越来越引起重视。开发盐藻作为生物反应器，可以生产多种具有生物活性的外源蛋白如抗肿瘤药物血管抑素、抗体和疫苗等。

在进行盐藻的转基因研究时，合适的筛选标记具有至关重要的作用。近年来，通过硝酸盐还原酶(nitratereductase，NR)基因的功能互补试验建立相应的选择标记体系已经先后在莱茵衣藻、团藻和小球藻中进行。

研究发现在大多数高等植物和藻类中，NR基因以单拷贝形式存在：而且NR基因的表达具有硝酸盐诱导特性。除此之外，氯酸盐作为硝酸盐的类似物，能够在NR的催化下，转变成对细胞有毒性的次氯酸盐。

因此，具有NR活性的野生型细胞不能抗氯酸盐毒性，只有NR活性缺失的细胞才具有氯酸盐抗性特征，利用这一特性可以较容易地筛选出NR缺陷型突变株用做转基因的受体，并以NR基因作为选择标记基因进行转基因研究。

与抗生素抗性基因及除草剂抗性基因相比，NR基因作为杜氏盐藻转基因研究的选择标记具有以下优点：

(1)遗传上比较稳定，且NR基因为硝酸盐诱导型基因，便于遗传操作；

(2)缺陷型突变株及转化株的筛选简单：在以硝酸盐为氮源的培养条件下，NR缺陷型突变藻株能够抗氯酸盐毒性，而野生藻株不能抗氯酸盐毒性，因此通过氯酸盐抗性筛选，可以较为容易的得到NR缺陷型突变株；带有NR基因的质粒转化NR缺陷型突变藻株后，非转化株在硝酸盐培养的条件下不能生长，因此未转化细胞背景低，便于转化株的筛出；

(3)成本低，不存在环境污染和生态安全问题。因此，NR基因是进行杜氏盐藻转基因研究比较理想的选择标记基因。建立NR基因选择标记体系是通过将NR基因转化NR缺陷型突变株，使其恢复NR活性而实现的。本研究室现已克隆出杜氏盐藻NR基因cDNA全长，并筛选得到了三株NR缺陷型突变藻株。为了建立杜氏盐藻NR基因选择标记系统，本研究进行了以下几部分的试验：电击转化盐藻细胞；现有的三株NR缺陷型突变藻株的表型分析；杜氏盐藻基因组中NR基因的拷贝数分析；氮源对杜氏盐藻NR基因的调控研究；最后构建了真核表达载体，采用先前建立的电击转化条件进行NR基因的功能互补试验获得成功。

实验方法

1．转基因杜氏盐藻藻株的建立

1．1真核表达载体p7NBT的构建以pMD-Pnr(含盐藻NR基因5’UTR)为模板，特异引物BSOE-1和BSOE-2为引物扩增Pnr；以pMDDC-B(含bar基因)为模板，BSOE-3和BSOE-4为引物扩增bar基因。然后利用改进的重叠区扩增基因拼接法(genesplicingbyoverlapextension，SOEing)扩增融合片段Pnr-bar。以含有3’UTR的载体pMD-Tnr为模板，扩增Tnr片段，PCR产物经胶回收纯化。纯化片段Tnr连入克隆载体pEGM-7zf构建中间载体，顺序将SOEing法得到的融合片段Pnr-bar连入中间载体pEGM-7zf-Tnr构建真核表达载体p7NBT，转化大肠杆菌JM109，筛选阳性菌落，酶切鉴定重组质粒。

1．2电击法转化杜氏盐藻采用改进的电击法将质粒p7NBT转化杜氏盐藻细胞。转化的盐藻先于暗处恢复培养12h，光照培养箱中正常培养48h后，按照3mg/L剂量加入PPT进行筛选培养。采用TRIzol裂解法提取转化盐藻细胞和阳性对照盐藻细胞总RNA，两步法进行RT-PCR扩增外源bar片段。

2．杜氏盐藻NR缺陷型突变藻株的表型分析

2．1杜氏盐藻NR缺陷型突变株生长试验将三株突变株在分别以硝酸盐和亚硝酸盐为唯一氮源的液体和固体培养基上培养，观察突变株的生长情况，并以野生型为阳性对照。

2．2杜氏盐藻NR缺陷型突变株NR活性的测定分别收集一定体积杜氏盐藻野生型与NR缺陷型突变株细胞，经硝酸盐诱导培养24h后采用离体法测定NR活性。

3．杜氏盐藻NR基因基因组拷贝数分析

根据已扩增得到的杜氏盐藻NR基因的第一外显子DNA序列设计一对特异引物，以携带有NR基因cDNA全长的质粒pMD-NRc为模板扩增238bp的DNA片段制备杂交探针。提取野生型杜氏盐藻基因组DNA，分别用HindⅢ、XhoⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ四种不同的限制酶充分酶切后进行Southernblot分析。

4．氮源对杜氏盐藻NR基因的表达调控

4．1Northernblot分析氮源对杜氏盐藻NR基因的转录调控根据NR基因cDNA序列设计特异引物扩增一段约990bp的DNA制备探针，提取5种不同氮源培养的盐藻细胞总RNA进行Northernblot分析。

4．2不同氮源对杜氏盐藻NR活性的影响采用5种不同氮源培养盐藻细胞，并于培养的第1d，2d，3d，4d，5d分别测定不同氮源组的NR活性。

5．真核表达载体pMDDCA-NR的构建

以携带有NR基因cDNA序列全长的质粒pMD-NRc为模板，扩增NR基因cDNA全长。用SmaⅠ酶切处理PCR产物，相同内切酶处理质粒pMDDC-B，T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌JM109。酶切鉴定插入片段的大小和方向。

6．杜氏盐藻NR缺陷型突变株的功能互补试验

6．1互补转化子的筛选在电容10μF，电阻400Ω，电压1.5kV的电击条件下将质粒pMDDCA-NR转化杜氏盐藻NR缺陷型突变株细胞。电击转化后的NR缺陷型突变株细胞经24h暗光恢复培养后转移至光照培养箱中，采用以硝酸钾为唯一氮源的固体培养基进行转化株的筛选。

6．2互补转化子的鉴定根据Genbank上登陆的DCA启动子3′端序列(AF541981)和NRcDNA的5′端序列设计特异引物，以转化株基因组DNA为模板，扩增约410bp跨启动子与NRcDNA的质粒DNA片段，纯化后送测序。同时以质粒pMDDCA-NR为模板，采用上述引物扩增同样大小目的片段制备杂交探针，进行Southernblot分析。分别提取转化株和阴性对照藻株总RNA，进行实时定量PCR，根据标准曲线分析互补转化子的NR基因转录水平。

实验结果

1．转基因杜氏盐藻藻株的建立

1．1真核表达载体p7NBT的构建利用改进的SOEing法扩增出了特异的约1700bp的融合片段。重组质粒p7NBT经酶切鉴定正确。采用T7和SP6引物双向测序，结果显示读码框完整，无突变，方向正确。

1．2电击法转化杜氏盐藻转化细胞经PPT筛选培养5天后可观察到转化盐藻在PPT筛选压力下能够正常生长，显微镜下观察细胞形态正常，活动性好；而未转化质粒p7NBT的阴性对照盐藻细胞则黄化死亡。提取转化盐藻总RNA，RT-PCR扩增得到约550bp的目的片段，测序结果证实为bar基因序列。

2．杜氏盐藻硝酸还原酶缺陷型突变藻株的表型分析

2．1杜氏盐藻NR缺陷型突变株生长试验NR缺陷型突变株在亚硝酸盐的固体和液体培养基上均生长良好，在硝酸盐的液体培养基中生长明显受到抑制但并没有完全死亡，不能在硝酸盐固体培养基上生长。

2．2杜氏盐藻NR缺陷型突变株NR活性的测定经NR活性测定试验证实，本研究室现有的三株杜氏盐藻NR缺陷型突变株经硝酸盐诱导后均未检测到NR活性。

3．杜氏盐藻NR基因基因组拷贝

分析杜氏盐藻基因组DNA经四种不同的限制酶充分酶切后进行Southernblot分析结果显示，HindⅢ、BamHⅠ酶切处理后只出现一条杂交带，以XhoⅠ酶切处理后有两条杂交带。因此NR基因在杜氏盐藻基因组中应以单拷贝形式存在。

4．氮源对杜氏盐藻NR基因的表达调控

4．1Northernblot分析氮源对杜氏盐藻NR基因的转录调控Northernblot结果显示，在硝酸盐存在或无氮培养条件下均可检测到特异的杂交条带，而当以铵作为唯一氮源存在时，无特异的杂交信号出现。各杂交信号无差别。

4．2不同氮源对杜氏盐藻NR活性的影响NR活性测定试验结果显示，在硝酸盐或硝酸盐与铵共同存在的条件下，NR的转录本均能翻译成有活性的蛋白；而在铵作为唯一氮源时，NR无活性。经硝酸盐诱导后，杜氏盐藻NR活性明显提高，3d时达到最大；而NH_4~+组及无氮源组的活性一直为零。

5．真核表达载体pMDDCA-NR的构建

不同酶切分别鉴定重组质粒pMDDCA-NR插入片段大小、方向均正确。

6．杜氏盐藻NR缺陷型突变株的功能互补试验

6．1互补转化子的筛选采用以硝酸钾为唯一氮源的固体培养基进行转化株的筛选。最后获得一株NR活性恢复藻株，其NR活性恢复为野生型的48.1％。6．2互补转化子的鉴定以转化株基因组DNA为模板，扩增出了约410bp的目的片段。测序结果显示，所扩增得到的片段与pMDDCA-NR质粒上跨DCA启动子3′端和NRcDNA5′端区域的DNA序列基本一致。将转化株基因组DNA采用质粒上的单酶切位点限制酶充分酶切后进行Southernblot分析，结果在检测到了与质粒对照大小一致的杂交信号。

实时定量PCR结果也显示，转化株的NR基因在mRNA表达水平上比对照的突变株提高了约3倍多。

结论

成功构建了以高盐诱导型启动子DCA驱动NR基因表达的真核表达载体pMDDCA-NR，采用电容10μF，电阻400Ω，电压1.5kV的电击条件通过功能互补试验使杜氏盐藻NR缺陷型突变株恢复部分NR活性(约为野生型的48.1％)，初步建立了杜氏盐藻NR基因选择标记体系。

【关键词】：杜氏盐藻硝酸盐还原酶功能互补试验选择标记

【学位授予单位】：郑州大学

【学位级别】：硕士