杜氏盐藻cDNA文库构建及表达序列标签分析

近年来,杜氏盐藻成为固定大气中CO2,减少温室效应,并产生生物能源的研究热点。

然而,杜氏盐藻的基因组信息尚未测序完成,关于杜氏盐藻的基因信息非常少,在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上,杜氏盐藻的核苷酸序列只有213条,表达序列标签(EST,ExpressedSequenceTag)仅有3936条。

而这些有限的基因信息,对于进一步研究杜氏盐藻是远远不够的。因此,构建一个高质量的杜氏盐藻的cDNA文库,为快速、方便的筛选和分析杜氏盐藻中的有价值的基因提供了平台,为构建遗传图谱和比较基因组学提供了依据。

我们在室内成功养殖杜氏盐藻(Dunaliellasalina)的基础上,绘制了杜氏盐藻在1.5mol/LNaCl盐浓度下的生长曲线。使用宝生物cDNA文库构建试剂盒,构建在1.5mol/LNaCl盐胁迫下的杜氏盐藻的cDNA文库。取处于生长对数期的杜氏盐藻,提取总RNA和mRNA后,利用反转录酶M-MLV合成cDNA第一条链,再将RNA链置换成DNA链,合成cDNA第二条链,加上EcoRI接头,NotI酶切后,经过SpinColumn除去短链cDNA,与载体pAP3neo进行连接,转化大肠杆菌DH10B。

经鉴定,原始文库的滴度达1.2×106cfu/mL,重组率高达95%,且多数插入片段均在500bp以上。随机挑取70个单克隆进行序列测定,得到66条非冗余序列。所测序列经过生物信息学方法分析后,除13个ESTs(ExpressedSequenceTags,表达序列标签)与NCBIGenbank中的已知盐藻EST高度同源外,其它EST均为新的未见报道过的表达序列标签,这些新的ESTs数据,很有可能编码杜氏盐藻中的独特基因,为进一步筛选和克隆杜氏盐藻耐盐性基因提供了筛选平台,为盐藻基因组以及EST数据库增补了大量信息。

【关键词】：杜氏盐藻cDNA文库表达序列标签

【学位授予单位】：华中科技大学

【学位级别】：硕士

【学位授予年份】：2009