杜氏盐藻生物学特征及表达载体pGEM-D18S-BAR的构建

杜氏盐藻(Dunaliellasalina)是唯一没有细胞壁的绿藻，也是真核生物中抗逆性最强的一种藻类。盐藻细胞呈梨形或椭圆形，体积为50-100μmM~3，是具两条等长鞭毛的单细胞绿藻，细胞由弹性细胞膜包围，细胞内有一个大的杯状叶绿体，叶绿体基部有淀粉核，杯状叶绿体的杯口有一个红色眼点，杯内有一个细胞核。

盐藻有无性生殖和有性生殖两种生殖方式，无性生殖以纵裂形式进行，有性生殖为同配生殖。盐藻作为天然β-胡萝卜素的来源已在我国及其它一些国家实现了规模养殖，对于盐藻的耐盐机理及光合机理也有较深入的研究。

盐藻作为生物反应器与微生物发酵、转基因动物等生物系统相比，具有许多潜在的优势，如用于生产口服疫苗和抗体。但至今尚未有关于转基因盐藻的较为系统的报道。本试验对杜氏盐藻生物学特性进行研究，并在此基础上构建了pGEM-D18S-BAR表达载体，用基因枪方法进行了转化。

方法和结果

1．盐藻的纯化：从国内外得到的五个藻种用低速重复洗涤法、连续传代法、少量氯霉素筛选法，对液体培养物进行纯化，然后在0.8％琼脂盐藻培养板上划线，再将单藻落挑取、培养，从而得到五个藻种的纯系。郑州大学2003届硕士学位论文杜氏盐藻生物学特征及表达载体pGEM一D18s一BAR的构建

2.盐藻定量方法及其线性关系测定:采用湿重、紫外一可见光吸收、计数方法定量并进行改进。采用600一80Onln波长扫描从而确定特征吸收波长为68Onln或685nm。直接用蒸馏水进行稀释，使细胞迅速膨大变形并丧失游动性后进行计数。结果显示，三种测定方法可用于盐藻的定量，并得到各定量数据间的对应关系。

3.盐藻培养条件筛选:对盐藻在五种培养基中的细胞数量、生长速度、总蛋白质和p一胡萝卜素含量进行测定和计算，筛选出相应的合适培养基。

4.盐藻选择标记确定:对分子生物学常用标记物进行筛选发现，盐藻对氯霉素和草丁嶙较为敏感。盐藻起始浓度为l一Zx1o“个/ml氯霉素10d时90%有效浓度(ECg。)除n.salina435为414.62mg/l，其它藻种为143.63一Z19.slmg/l，草丁磷lod的EC90为4.44一6.49mg/l。初步确定用于筛选基因枪转化转基因盐藻的氯霉素的用量为200m留1，草丁嶙为3.Om酬。

5.盐藻D.salina(UTExLB1644)185核糖体RNA基因的扩增和克隆:根据Genbank登录序列(序列号M84320)设计引物，以D.salina基因组DNA为模板进行扩增，得到1122饰基因片段。将该片段克隆到载体pGEM一7zf，构建载体pGEM一5155。经测序和与oenbank登录序列比对，该片段为盐藻185核糖体RNA基因片段。

6.盐藻表达载体构建:经酶切、连接使两个185核糖体RNA基因片段同向连于pGEM一7zf载体，构建载体pGEM一D185。酶切质粒pBARGUS获得带有花椰菜花叶病毒(eauliflowermosaievirus，eaMV)355启动子、郑州大学2003届硕士学位论文杜氏盐藻生物学特征及表达载体pGEM一D18S一BAR的构建bar基因(编码PPT乙酞转移酶使其自由氨基乙酞化而丧失毒性)和胭脂碱合成酶(nopalinesynthase，NOS)3’端终止序列的片段，将该片段与载体pGEM一D185连接构建表达载体pGEM一D155一BAR。

7.盐藻的转化和筛选:将载体pGEM一D185一BAR用基因枪方法转化盐藻D.Salina(uTExLB1644)，加入草丁嶙进行筛选。结果显示，bar基因在转化盐藻中有瞬时表达。

结论

1.湿重、紫外一可见光吸收、计数三种定量方法可用于盐藻的定量，可视不同情况选用不同方法。湿重、紫外吸收、计数数据间的相互对应关系可用于三种定量方法数据之间的换算。

2.氯霉素和草丁麟对盐藻有抑制作用，故编码氯霉素乙酞转移酶(chloromyeetinacetyltransferase)的eAf基因和编码草丁麟乙酞转移酶(phosphinothricinacetyltransferase)的bar基因可用于盐藻基因工程。

3.以盐藻185核糖体RNA基因片段为同源片段，bar基因为选择标记，caMV35S启动子启动bar基因的表达，构建载体pGEM一D18S一BAR，基因枪方法转化盐藻，观察到bar基因在盐藻中可瞬时表达。

4.CaMV35S启动子并非盐藻的特异启动子，在盐藻中活性可能不高，故应对盐藻的特异高效诱导型启动子进行研究。此外，还应对促进外源基因在盐藻中稳定表达、防止转基因沉默的对策进行研究。

【关键词】：杜氏盐藻生物反应器定量选择标记表达载体转化