巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与分析

（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510006）（2.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）
摘要：八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是巴氏杜氏藻（Dunaliella bardawil）类胡萝卜素生物合成途径中的上游关键酶。本研究根据NCBI 上已发布的巴氏杜氏藻 mRNA 序列（GenBank: Y14807），设计特异性引物，通过基因组步移法及半巢式 PCR 的方法，获得PDS 编码区序列。在编码区序列获取过程中，发现 5’端编码区有 325 bp 序列与 NCBI 上公布的 cDNA 序列有所不同，故采用了 5’RACE技术进行验证，经过比对发现结果与本实验基因组步移所获得序列相匹配，推测 NCBI 公布mRNA 序列的PDS 与本实验获取的PDS可能为同工酶。然后根据获得的序列，再利用基因组步移 PCR 的方法获得其两端侧翼序列：启动子和终止子，并利用生物信息学工具对其进行分析。实验获得的完整 PDS 基因全长 12678 bp，其中编码区序列长度为 8113 bp，编码区上游序列 3010 bp，编码区下游序列1555 bp，编码区序列含有 12 个外显子和 11 个内含子。通过生物信息学分，发现PDS 启动子中具有多种转录因子结合位点。
关键词：八氢番茄红素脱氢酶；巴氏杜氏藻；基因组步移；巢式 PCR；启动子
文章篇号：1673-9078(2013)8-1756-1760

类胡萝卜素（Carotenoids）呈黄色，红色或橙红色，是由异戊二烯为基本单位的萜类化合物，不溶于水，溶于脂肪溶剂，亦称脂色素。类胡萝卜素普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类中，截止至 2008年，发现的类胡萝卜素的种类达到 600 多种。类胡萝卜素具有重要的生物学功能，如抗氧化，增强人体免疫系统，延缓衰老，抗癌防癌以及预防其他慢性疾病等。
八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是植物类胡萝卜素代谢途径中的一个关键酶，调控八氢番茄红素转化为β-胡萝卜素（如图 1）。若哒草伏和氟啶酮与 PDS 活性
收稿日期：2013-03-25
基金项目：国家自然科学基金项目（31171631）
作者简介：姜建国（1964），男，博士，教授，生物化学与分子生物学 位
目前，一些植物以及微藻的 PDS 基因的 cDNA 序列陆续被克隆并研究。在番茄、柑橘、黄花龙胆、金盏菊等花或果实中以类胡萝卜素为主要色素种类的植物中，PDS 基因的表达能促进花和果实中类胡萝卜素的积累。

巴氏杜氏藻（Dunaliella bardawil）简称巴氏藻，是商业生产 β-胡萝卜素的主要微生物之一，能在强光照，高盐度，低营养的条件下积累 β-胡萝素，可达到细胞干重的 14%。而本实验室一直致力于研究巴氏藻类胡萝卜素代谢途的各种酶基因的克隆以及对其代谢调控机理的研究。本实验以巴氏藻为研究对象，利用 NCBI 上已发布的巴氏杜氏藻 mRNA 序列（GenBank:Y14807）克隆 PDS 编码区序列，进而再利用基因组步移克隆获得启动子和终止子，最后利用生物信息学工具分析 PDS 基因，包括 PDS 基因编码区序列的组成、启动子转录起始位点的预测及其转录因子结合位点的分析等。