2株盐藻生长和生化组成的影响

摘　要:采用正交设计法研究了C、N、P比例对2株盐藻OUN04和OUN05生长、β-胡萝卜素积累、叶绿素a合成、脂肪酸组成、蛋白质含量的影响。试验结果表明,适当调节C、N、P比例可以促进盐藻OUN04生长、β-胡萝卜素积累、叶绿素a合成,盐藻OUN04最大细胞密度114.2×104个/ml、β-胡萝卜素最大含量100.4 mg/g、叶绿素a最高含量144.6 mg/g分别出现在C、N、P比例为12∶1∶0.05、12∶2∶0.1、12∶1∶0.05的处理组中,且均与对照组差异显著;适当调节C、N、P比例也可以提高盐藻OUN04脂肪酸和蛋白质含量。盐藻OUN05细胞最大密度101.2×104个/ml、β-胡萝卜素最高含量109.2 mg/g、叶绿素a最高含量108.7 mg/g分别出现在C、N、P比例为6∶2∶0.05、6∶0.5∶0.1、12∶2∶0.1的处理组中,且均与对照组差异显著;最大蛋白含量34.41%出现在6∶1∶0.05的处理组中,但与对照组(33.17%)差异不显著。

关键词:C、N、P比例;盐藻;生长;β-胡萝卜素

中图分类号:Q946文献标识码:A文章编号:1003-1111(2010)03-0131-06

收稿日期:2008-11-25;　修回日期:2009-05-04.

基金项目:国家“863”计划项目(863-819-04-10);临沂师范学院博士科研启动基金资助项目(BS07004).

作者简介:王培磊(1966-),男,副教授,博士,研究方向:海洋生物学;E-mail:wangpeilei@lytu.edu.cn.

盐藻(Dunaliella salina),为双鞭毛的单细胞绿藻,广布于内陆盐湖和盐田,可耐高盐(20～350),个体较大(16～24)μm×(10～13)μm,合成的β-胡萝卜素可达干质量的14%,为自然界所有生物之首[1]。盐藻还是水产养殖动物(对虾、扇贝、鲍等)良好的单细胞蛋白饲料,而且具有生产甘油的潜在发展前途[2]。美国、澳大利亚、以色列、日本等很早就开始了盐藻形态构造、分类、生态特性、DNA分子标记、β-胡萝卜素异构体的空间结构、光抑制、胁迫β-胡萝卜素合成的环境条件等方面的研究,并已经投入工业化生产[3]。我国拥有漫长的海岸线(18 000 km)和众多的内陆盐湖,具有养殖盐藻生产β-胡萝卜素优越的自然条件。前人对盐藻的研究多集中在光照、温度、盐度及营养盐等对藻生长、超微结构、光合作用、β-胡萝卜素和甘油积累及生化组成的影响上[3-4],而3种重要营养盐C、N、P之间的比例对盐藻生长的影响研究尚未见报道。笔者研究了C、N、P比例对2株盐藻生长、色素积累和细胞生化组成的影响,以期为优化盐藻培养基配方、降低生产成本、提高藻及其β-胡萝卜素产量提供参考。

1.材料与方法

1.1　藻种

盐藻OUN04和盐藻OUN05均由内蒙古兰太股份有限公司生物分公司提供,中国海洋大学海洋生命学院单克隆分离筛选。

1.2　培养条件

1.2.1　培养基

饱和卤水取自内蒙古兰太盐湖,用蒸馏水稀释至盐度120。一次性添加柠檬酸铁0.01 mmol/L。培养基C、N、P比例和浓度由三因素(C、N、P)、三水平(C:12、6、3 mmol/L,N:2、1、0.5 mmol/L,P:0.2、0.1、0.05 mmol/L)正交设计法给出,并以其中的C∶N∶P=3∶1∶0.1(内蒙兰太生物公司生产使用的C、N、P比例)为对照。其中N源为NaNO3,C源为NaHCO3,P源为KH2PO4。

1.2.2　培养方法

(25±1)℃ ,日光灯照明,光照度4000 lx,光暗周期16L∶8D;250 ml三角烧瓶培养,工作体积150 ml;取对数生长期藻种接种,接种密度5.0×104个/ml。每日摇瓶6次,试验设3个平行样,即每一种处理设置3个完全一样的瓶子,测定细胞密度和β-胡萝卜素含量等可取3个瓶子的平均数;重复2次。1.3　测定指标和测定方法

1.3.1　细胞计数

血球计数板法计数,每个样计3次,取其平均数,每日计数1次。

1.3.2　β-胡萝卜素的测定[5]

培养至第11 d时,取藻液5 ml,加入90%丙酮充分萃取后,取上清液,用90%丙酮定容至50 ml,摇匀,用721分光光度计测定波长于450 nm处的吸光值OD450 nm,按下式计算干藻粉中的β-胡萝卜素含量:β-胡萝卜素含量(mg/g)=[定容体积(ml)×10×OD450 nm]×1000÷[2500×取样体积(ml)]

1.3.3　叶绿素a的测定[5]

培养至第7 d,取藻液5 ml,加入90%丙酮充分萃取,后取上清液,用90%丙酮定容至50 ml,摇匀,用721分光光度计分别测定波长于663 nm、645nm处的吸光值OD663 nm、OD645 nm,按下式计算干藻粉中的叶绿素a含量:叶绿素a含量(mg/g)=(8.02×OD663 nm+20.21×OD645 nm)×定容体积(ml)÷取样体积(ml)

1.3.4　pH值

用Orion Model 828型酸度计测定藻液pH值,每日1次。1.3.5　脂肪酸测定[6]取冷冻干燥的样品0.1 g,经皂化、甲酯化,萃取,气相色谱仪(HP-5890型)测定脂肪酸组分,按峰面积归一化法计算脂肪酸组分百分含量。

1.3.5　蛋白质含量测定

试验结束时,取藻液500 ml,离心,蒸馏水冲洗藻泥,再离心,重复3次,冷冻干燥,取干藻粉0.1～0.2 g,凯氏定氮法测定蛋白质含量。

1.4　数据处理

采用SPSS软件包对结果进行统计分析,以0.05作为差异显著性水平。

2.结果

2.1　C、N、P比例对盐藻生长的影响

盐藻OUN04细胞密度最大值114.2×104个/ml出现在12∶1∶0.05处理组中第9 d,对照组为89.3×104个/ml(P<0.05)。分析发现,低N组细胞密度均较低,说明N是影响细胞生长的主要营养元素,其作用超过C和P。C、N、P比例对盐藻OUN05生长的影响见表2。由表2可见,盐藻OUN05细胞密度最大值101.2×104个/ml出现在6∶2∶0.05组中,其次为12∶2∶0.1组,最大值为85.7×104个/ml,对照组为72.1×104个/ml(P<0.05)。在试验范围内,较高的N盐有利于盐藻OUN05的生长。