杜氏盐藻多糖的提取、分离分析及其生物活性的研究

杜氏盐藻(Duanaliellasalina)是单细胞、无细胞壁的绿藻类浮游生物，一般生长于海水、咸水湖及盐池中。人工大规模培养杜氏盐藻主要用于生产β-胡萝卜素。以往人们对杜氏盐藻的生物学特性和生产培养技术及其中积累的高含量β-胡萝卜素的提取分离研究较多，而对杜氏盐藻中高达10-40％的多糖类物质的研究利用较少，尤其是对其多糖的组成、结构及生物活性等方面的基础研究不够系统和深入。

从盐藻中提取出β-胡萝卜素后的藻渣中仍含有丰富的多糖、蛋白质、维生素及微量元素等可利用的营养成分，其中多糖具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性。因此，深入研究和开发盐藻多糖，对于充分利用盐藻渣资源，提高盐藻开发的综合效益具有重要意义。

本论文对提取出β-胡萝卜素后的杜氏盐藻渣中多糖的提取、分离分析(包括分离纯化、纯度鉴定、相对分子量分布分析、组成及结构分析)及其生物活性等方面进行了较系统深入的研究和探索。结果如下：分析了原料杜氏盐藻渣粉的化学组成为：总蛋白43.15％，粗脂肪0.4％，总糖15.40％，粗纤维0.35％，灰分15.13％，水分8.24％。在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析法，以多糖得率为响应值作响应面，并进行回归分析，其结果表明，杜氏盐藻多糖提取的最佳工艺条件为：提取温度81℃，提取液pH8.80，提取时间210min；液料比为16:1(v/w)时，杜氏盐藻多糖的得率达到8.77％。

以最佳工艺提取得到的杜氏盐藻粗多糖的化学组成为：多糖78.31％，糖醛酸3.81％，蛋白质4.40％，硫酸基3.27％，灰分7.60％。最佳工艺的碱性提取条件下，多种不同相对分子量分布和不同性质的多糖组分均能得到较充分的提取，而水提工艺不仅得率低，而且粗多糖产品中，相对分子量100KDa以上的粗多糖含量较少。

将杜氏盐藻粗多糖经DEAESepharoseFastFlow柱层析分离得到PD1、PD2、PD3、及PD4四个级分，PD4又通过SepharoseCL6B柱层析分离得到PD4a和PD4b两个级分。高效体积排阻色谱和琼脂糖凝胶电泳及高效毛细管电泳分析结果显示，PD4a、PD4b、及PD1、PD2和PD3皆为均一组分。

对PMP柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中单糖组成的色谱分离和衍生化条件及PD4a、PD4b的水解条件进行了优化和改进，并以改进的方法测定了五个杜氏盐藻多糖级分的单糖组成，利用离子色谱法对PMP柱前衍生化高效液相色谱法的测定结果进行了验证，两方法结果基本一致。

改进后的PMP柱前衍生化高效液相色谱法同时分析12种单糖的色谱分离条件为：色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C18，250mm×4.6mmid,5μm；流动相：0.1mol/L磷酸盐(pH6.7)缓冲液-乙腈(体积比为83:17)；优化的衍生化反应时间为100min，中和反应产物的pH为6.7；适合PD4a和PD4b的水解条件分别为：2mol/LTFA，110℃，4h和2mol/LTFA，121℃，2h。化学分析、高效液相色谱和紫外、红外光谱分析及核酸酶水解法分析结果表明：PD1是相对分子量为1548KDa硫酸化葡聚糖(硫酸基含量为6.93％)，PD4a为相对分子量为424，KDa、含有糖醛酸和少量肽链的硫酸化杂多糖(硫酸基含量为8.36)；PD4b是一相对分子量为424KDa、含有少量糖醛酸和肽链的核酸多糖复合物，其中以共价结合的核酸含量为49.26~,，0；PD2和PD3均为葡聚糖，相对分子量分别为33KDa和67KDa，PD3且含有少量肽链。PD4a的单糖组成为(mol％)：Man：Rib:Rha:GlcUA:GalUA:Glc:Gal:Xgl:Ara:Fuc=5.04:0.71:3.6:2.41:5.26:5.38:42.04:11.56:19.48:4.52；PD4b也由上述10种单糖组成，其摩尔比为：3.48:67.80:1.34：2.36:2.70：4.69：8.40：4.25：3.61：1.37。

PD4b中核酸的碱基组成(mol％)为：G:A:C:U:T=39.18：40.54：10.67：0.75：8.86。五个多糖级分PD1，PD2，PD3，PD4a及PD4b的糖残基异头碳构型均为α型，旋光性分析的结果与红外光谱及单糖组成分析结果一致。

通过对杜氏盐藻中提取出的不同多糖级分，主要是PD4a、PD4b及PD1三级分在HPSEC柱上的保留和分离特性及其影响因素的考察，较好地优化了分离分析条件，研究建立了HPSEC分析盐藻多糖的方法，并将该方法成功地应用于盐藻多糖分离级分(特别是PD4)的纯度鉴定和相对分子量及其分布的测定，并针对PD4a，PD4b及PD1三者在不同条件下表现出的“二级效应”，特别是硫酸基的非特异性吸附作用及其对多糖的保留行为的影响进行了有意义的探索。

其结果表明：要消除硫酸基的“二级效应”，对于相对分子量较大的硫酸化多糖，流动相中盐的浓度需较大，对于相对分子量较小的硫酸化多糖，则盐的浓度可较小；NaNO<,3>和NaC1的水溶液不宜取代NaAc溶液作为本文选定的色谱柱条件下的流动相用于盐藻多糖的HPSEC分离分析，同样浓度的不同种盐溶液的离子强度及对“二级效应”的抑制作用相差较大。甲基化分析和核磁共振分析结果表明：PD1是一线型的α-(1→4)-D-葡聚糖，在部分0-6上取代有硫酸基。

PD4a主要由1，4-连接的α-D-Galp构成主链，在主链Gal的2或3位有多种类型的分支，分别由Ara，Xyl，Rha，Gal构成非还原末端；其中一种含量较高的分支是由Ara取代于1，4-连接的主链半乳糖的3-O上；硫酸基主要取代于主链的Gal的C2位；支链中含有2-Gal，3-Gal，3,6-Gal，4-Glc，2-Rha多种连接方式的糖基。体外促脾淋巴细胞增殖活性结果表明：PD2、PD3均没有明显的促脾淋巴细胞增殖活性，而PD1、PD4和由PD4进一步分离得到的PD4a和PD4b两个组分均有显著的促脾淋巴细胞增殖活性，并具有量效关系。PD1、PD4圾PD4a具有显著协同ConA促脾淋巴细胞增殖活性，但无明显的量效关系；PD4b无明显协同ConA促脾淋巴细胞增殖活性。

PD1、PD4a、PD4b均无协同LPS促进脾淋巴细胞增殖活性。此外，PD4a还能显著地促进正常小鼠脾淋巴细胞生成IL-2。

因此，PD1、PD4及PD4a具有显著促进小鼠的特异性免疫的功能，主要是特异性的细胞免疫功能。体内对正常小鼠碳粒廓清速率的影响实验结果显示，PD4b、PD1和降解后的PD4a能显著提高小鼠的中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬能力，因而具有显著提高小鼠非特异性免疫功能的活性。另外，PD4a和PD4b还对正常小鼠的血清溶血素具有显著的促进作用，均能显著提高小鼠特异性体液免疫功能。

脱硫和降解后PD4a及酶解后PD4lb的体外促脾淋巴细胞增殖活性试验与体内对正常小鼠碳粒廓清速率的影响实验的结果均表明：PD4a的硫酸基和PD4b的核酸部分分别与两者的免疫活性有一定的相关性；适当的降解可提高PD4a的免疫活性。体外抗病毒活性的试验证实，杜氏藻中硫酸化多糖PD4a具有显著的抗流感病毒活性。PD4a的相对分子量为424KDa，与Fabregas关于杜氏藻(D.tertiolecta)中抗病毒的活性成分可能是相对分子量为500KDa左右的硫酸化多糖的推测相吻合。体外试验结果显示：PD4对S180、A549和MDA-MB-231三种肿瘤细胞具有一定的抑制作用，对KB和Lovo肿瘤细胞的抑制率较高，最高抑制率在60％左右；PD4a和PD4b对KB和Lvov肿瘤细胞均有一定的抑制作用。

该结果表明，PD4和PD4a、PD4b对上述肿瘤细胞有一定的细胞毒作用。体内抗肿瘤试验结果显示：PD4高剂量组对小鼠S180肉瘤有明显的抑制作用，抑瘤率达30.58％，且能提高荷瘤小鼠的胸腺指数；低、中、高剂量组对小鼠}teps肝癌具有一定的抑制作用，以中剂量组的作用较强，其抑瘤率达31.16％，且能提高荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数。PD4a中、高剂量组对小鼠S180肉瘤有显著的抑制作用，抑瘤率分别为32.89％和37.48％，且能显著提高荷瘤小鼠的胸腺指数；PD4b高剂量组对小鼠S180肉瘤有显著性抑制作用。