不同提取方法对盐藻β-胡萝卜素产量的影响

滕长英,张立,邹宁,吴云杰　(鲁东大学生命科学学院,山东烟台264025)

摘要：[目的]研究不同提取方法对盐藻β 胡萝卜素产量的影响,以改进盐藻β 胡萝卜素的提取工艺。[方法]首先比较了丙酮∶甲醇(7∶2)和石油醚2种常用提取试剂对盐藻β 胡萝卜素提取效率的影响;然后以丙酮-甲醇(7∶2)为提取试剂,分别从提取时间、提取温度、固液比3个方面对其提取工艺进行了优化。[结果]相对于石油醚,丙酮∶甲醇(7∶2)对盐藻β 胡萝卜素的提取效率较高。4℃和25℃浸提温度下β 胡萝卜素的得率没有明显差异。分3次提取时,5ｍｉｎ的浸提时间即可获得较高的提取效率。在1～7ｍｌ的提取剂使用范围内,随着提取剂用量的增加β 胡萝卜素的提取效率有所增加,但增加幅度不是很大。结论]以丙酮∶甲醇(7∶2)为提取试剂,在25℃下浸提5ｍｉｎ3次可以得到较高的提取效率。

关键词　杜氏盐藻;β 胡萝卜素;提取

中图分类号　Ｓ968.41　　文献标识码　Ａ　　文章编号　0517-6611(2008)29-12546-02

基金项目　山东省科技厅基金(2006ＧＧ3202027)。

作者简介　滕长英(1975-),女,山东齐河人,博士,副教授,从事微藻生物技术的教学与科研工作。

收稿日期　2008-07-23

β 胡萝卜素是一种重要的天然食用色素,属四萜类化合物,广泛地存在于植物、藻类和真菌中,是所有类胡萝卜素中含量最大和研究的最多的一种。胡萝卜素不溶于水,微溶于植物油,在脂肪族和芳香族的烃中有中等的溶解性,最易溶于氯化烃,如氯仿等。所以,在胡萝卜素加工提取过程中,溶剂的选择是十分重要的。

目前,全球对β 胡萝卜素的需求量与日俱增,近年来一直供不应求。β 胡萝卜素作为一种功能性色素,在被用作食品和化妆品添加剂的同时,还受到医学界的广泛注目,因此,研究和开发生产β 胡萝卜素成为当前一个很重要的课题。从植物中提取β 胡萝卜素,由于受季节、气候、产地和运输等条件的限制,加上植物的β 胡萝卜素含量低,因此很难实现大规模生产。

盐藻是海洋浮游生物,系单细胞藻,属于绿藻门(Ｃｈｌｏｒｏ-ｐｈｙｔ)绿藻纲(Ｃｈｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ)团藻目(Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ)盐藻科(Ｄｕ-ｎａｌｉｅｌｌａｃｅａｅ),广泛生存于盐田的低中级卤水池中,耐盐性好,在人工控制的适宜条件下可进行大量繁殖。在一定的胁迫条件下,盐藻可以产生和积累大量的β 胡萝卜素,如生产上已经用的巴氏杜氏藻(Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｂａｒｄａｗｖｉｌ)、盐生杜氏藻(Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓａｌｉｎａ)的胡萝卜素含量可达干重的10%以上。

20世纪70年代,世界上就有许多国家开始对盐藻养殖并对β 胡萝卜素的提取进行研究,80年代已有几家公司形成商业化生产,如美国的微生物资源公司、澳大利亚的西部生物工程公司等。我国有漫长的海岸线,卤水资源丰富,进行大面积的盐藻养殖有着便利的条件,也为从盐藻中提取胡萝卜素打下了必要的物质基础。

利用盐藻生产β 胡萝卜素已成为目前国内外生产天然β 胡萝卜素的主要方法,目前国内对此课题的研究主要集中于如何通过改变盐藻的培养方式提高色素的产量。为此,笔者通过比较各影响因素对β 胡萝卜素提取效率的影响探索和改进盐藻β 胡萝卜素的提取工艺,旨在为生产提供参考。

1、材料与方法

1.1　材料　盐生杜氏藻(Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓａｌｉｎａ)藻种为鲁东大学生命科学学院实验室保存。以5×104的接种量接到无菌的液体培养基中(培养基组成为:海水添加硝酸钠100ｍｇ/Ｌ、柠檬酸铁1ｍｇ/Ｌ、磷酸二氢钾10ｍｇ/Ｌ、ＺｎＳＯ4·7Ｈ2Ｏ22μｇ/Ｌ、ＣｏＣｌ·6Ｈ2Ｏ10μｇ/Ｌ、ＣｕＳＯ4·5Ｈ2Ｏ1μｇ/Ｌ、ＮａＭｏＯ4·2Ｈ2Ｏ6μｇ/Ｌ、ＭｎＣｌ2·2Ｈ2Ｏ8μｇ/Ｌ),在25℃、12ｈ光照/12ｈ黑暗的光照周期下培养。

1.2　提取试剂对β 胡萝卜素提取效率的影响　试验对目前β 胡萝卜素提取中最有效的2种提取试剂:石油醚和丙酮∶甲醇(7∶2)进行了提取效率的比较,试验方法如下。

1.2.1　石油醚对盐藻中β 胡萝卜素的提取。

(1)在离心管中加入100ｍｌ培养10ｄ的盐藻液,5 000ｒ/ｍｉｎ离心4ｍｉｎ,倒掉上清液,保留藻泥。将藻泥转移到碘量瓶中,静置5ｍｉｎ,加入丙酮5ｍｌ,石油醚5ｍｌ,摇振1ｍｉｎ,静置5ｍｉｎ,取5%硫酸钠水溶液15ｍｌ,放入125ｍｌ分液漏斗中,将碘量瓶中提取剂移入分液漏斗中,再以丙酮∶石油醚(3∶7)10ｍｌ加入碘量瓶中,摇振1ｍｉｎ,静置5ｍｉｎ,提取剂并入分液漏斗中。如此反复2～3次,直至提取剂无色为止。

(2)振动分液漏斗,放置待分层后,弃去水层,再用5%硫酸钠溶液15ｍｌ振摇洗涤,反复3次,以除净丙酮,防止乳化。

(3)在分液漏斗中加入1～2ｇ无水硫酸钠,然后将提取责任编辑　姜丽　责任校对　安徽农业科学马君叶,ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ.Ｓｃｉ.2008,36(29):12546-12547,12559剂投入烧杯中。用少量石油醚分数次洗净分液漏斗及无水硫酸钠上的色素,洗涤液并入烧杯中。用吹风机低温蒸发至约1ｍｌ。取下冷却,挥发至干,待干时,立即用丙酮2ｍｌ沿壁将色素洗下,混匀。4℃冰箱下保存。

1.2.2　丙酮-甲醇对盐藻中β 胡萝卜素提取。在离心管中加入100ｍｌ培养10ｄ的盐藻液,5 000ｒ/ｍｉｎ离心4ｍｉｎ,倒掉上清液,保留藻泥。将藻泥转移到碘量瓶中,静置5ｍｉｎ。加入5ｍｌ丙酮∶甲醇(7∶2)提取剂,在室温下振荡浸提,离心取上清液得第1次抽提液。沉淀中再加入5ｍｌ提取剂,室温下

继续振荡抽提,离心取上清液即得第2次抽提液;沉淀再重复抽提得第3次抽提液。合并3次抽提液。用吹风机,低温蒸发约1ｍｌ,取下冷却,挥发至干,待干时,立即用丙酮2ｍｌ沿壁将色素洗下,混匀。4℃冰箱下保存。

1.2.3　β 胡萝卜素的检测。取0.1ｍｌ上述2种方法提取的提取剂,然后用丙酮稀释至3ｍｌ,混合均匀。用721ＭＣ型紫外可见光分光光度计测其在480ｎｍ波长下的吸光度值。根据下列公式计算单位培养液中β 胡萝卜素的含量:ρ(ｍｇ/Ｌ)=(ＯＤ480-0.638×ＯＤ645+0.114×ＯＤ663)×稀释倍数÷0.218式中,ρ为单位培养基中β 胡萝卜素的浓度。