CNP对杜氏盐藻突变藻株zeal生长和积累玉米黄素的影响

杜氏盐藻(Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓａｌｉｎａ)是一类在食品、饲料、医药保健、化工和养殖业中都有独特经济价值的微藻。

它能在高盐环境中生长[1],具有极强的耐盐性和渗透调节能力[2]。杜氏盐藻体内能合成并积累玉米黄素。

玉米黄素(Ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ,3,3′-二羟基-β-胡萝卜素,分子式Ｃ40Ｈ56Ｏ2)是一种天然类胡萝卜素,属萜烯类不饱和化合物,常与隐黄素、胡萝卜素、叶黄素等共存,组成类胡萝卜素的混合物[3]。玉米黄素具有较强的清除脂质过氧化自由基的能力,可作为自由基清除剂[4]。大量研究表明,玉米黄素具有预防老年性黄斑病变、白内障,预防心血管疾病,抗癌等功效。另外,玉米黄素本身也具有很高的营养价值,食用后可在人体肝脏内转化成具有生物活性的维生素Ａ,对促进人体的生长发育、保护视力与上皮细胞、提高抗病能力、延长寿命等。

而玉米黄素,作为一种有效的抗氧化剂和高价值的生物产品,目前在商业上还没有被广泛应用,主要是由于在正常情况下,它在植物组织中的产量极低,但这一合成途径可在一些原核生物,如蓝细菌体内发生,这就为我们提供了一种在活体内通过代谢工程的方法来获得玉米黄素的新途径。研究表明,杜氏盐藻通过诱

变,可在藻体内大量积累玉米黄素[6]。因此进行微生物的诱变筛选,探究影响高产玉米黄素突变藻株积累

玉米黄素因素,为实验室和工厂大规模生产玉米黄素提供理论依据。

1　材料和方法

1.1　材料

杜氏盐藻(Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓａｌｉｎａ)藻种由中国科学院青岛海洋研究所提供,经本实验室纯化并保存为野生型藻株(ＷＤ)。培养条件为光照强度2500～3000Ｌｕｘ,光暗比14ｈ∶10ｈ。

1.2　方法

1.2.1　诱变和突变体的筛选

1)紫外线诱变:吸取藻液5ｍＬ于无菌培养皿中,在紫外灯下分别照射0、10、0、30、40、50、60ｓ,暗培养48ｈ后稀释涂平板,光照培养,30ｄ后观察结果。

2)ＮＴＧ诱变:取藻液5ｍＬ于离心管中,加入ＮＴＧ溶液,使盐藻藻液中ＮＴＧ的最终浓度呈0.001ｍｇ/ｍＬ,30℃下分别振荡培养0、30、60ｓ、2、3、4、5、10、15、20、25、30ｍｉｎ,离心收集藻细胞,磷酸缓冲液清洗,12ｈ暗处理后稀释涂平板,光照培养,30ｄ后观察结果。

3)挑选呈灰绿色或黄色的藻落,测定其玉米黄素含量,并与野生型出发藻株进行比较,证明其是否为高产玉米黄素突变藻株。

1.2.2　碳源对突变藻株Ｚｅａ1生长和积累玉米黄素的影响

液体培养基中分别加入葡萄糖、蔗糖、ＮａＨＣＯ3,并分别设置5个浓度梯度:0、5、10、15、20ｍｍｏｌ/Ｌ;按10%接种量接种,150ｍＬ的三角瓶接种45ｍＬ,每组设置3个平行,培养16ｄ后取样测定突变株藻细胞数和玉米黄素含量。

1.2.3　氮源对突变藻株Ｚｅａ1生长和积累玉米黄素的影响

液体培养基中分别加入ＫＮＯ3、ＮａＮＯ3、(ＮＨ4)2ＳＯ4,并分别设置5个浓度梯度:0、0.5、1、2、3ｍｍｏｌ/Ｌ;按10%接种量接种,150ｍＬ的三角瓶接种45ｍＬ,每组设置3个平行,培养16ｄ后取样测定突变株藻细胞数和玉米黄素含量。

1.2.4　磷酸盐浓度对突变藻株Ｚｅａ1生长和积累玉米黄素的影响

液体培养基中加入ＫＨ2ＰＯ4并设置5个浓度梯度:0、0.1、0.2、0.3、0.4ｍｍｏｌ/Ｌ;按10%接种量接种,150ｍＬ的三角瓶接种45ｍＬ,每组设置3个平行,培养16ｄ后取样测定突变株藻细胞数和玉米黄素含量。

1.2.5　玉米黄素含量的测定

采用ＨＰＬＣ(高效液相色谱分析法)和质谱分析法测定和鉴定玉米黄素。ＨＰＬＣ条件:色谱柱ＺＯＢＡＸ Ｃ18(4.6×250ｍｍ,5μｍ);流动相乙腈∶二氯甲烷∶甲醇(75∶20∶5,含0.1%ＢＨＴ);检测压强130Ｂａｒ,检测波长450ｎｍ;进样量20μＬ;流速0.8ｍｌ/ｍｉｎ;柱温25℃,检测系统Ａｇｉｌｅｎｔ

1100。质谱条件:Ａｇｉｌｅｎｔ6210ＴｉｍｅｏｆＦｌｉｇｈｔＬＣ/Ｍ8,色谱柱ＡｔｌａｎｔｉｃｓｄＣ18,39＊150ｍｍ;柱温25℃,碎片电压4000Ｖ,阳离子模式;进样量5ｕＬ;洗脱条件:(Ａ:甲醇,Ｂ:乙腈,0～15ｍｉｎ,Ｂ:84%～100%);流速0.8ｍＬ/ｍｉｎ。

2　实验结果

2.1　玉米黄素的测定和诱变的结果

通过ＮＴＧ诱变后,我们从平板上挑选灰绿色或和黄色的藻落,提取其中玉米黄素,ＨＰＬＣ测定其玉米黄

素含量,并与野生型出发藻株进行比较,得到三株玉米黄素高产突变藻株,其中突变株Ｚｅａ1中玉米黄素含量最高,为野生型的2.65倍,确定Ｚｅａ1为实验藻株。

本实验开始进行全波段扫描,结果在450ｎｍ有最大吸收峰值,与本人先前实验吻合。选用阴离子模式,结果无电离峰出现,再次选用阳离子模式,结果在450ｎｍＨＰＬＣ紫外吸收峰时出现电离峰。选取此峰进

行物质分子量及结构式分析,得出此物质分子量为551.45900,分子式为Ｃ40Ｈ55Ｏ,而玉米黄素分子量为568.149,分子式为Ｃ40Ｈ56Ｏ2,分子量相差17,刚好相差一个ＯＨ-,考虑到实验选取的为阳离子模式,玉米黄素分子脱去一个ＯＨ-,成阳离子状态,与前面得到的结果相吻合。证明在450ｎｍ处最大吸收峰为玉米黄素。