螺旋藻/节旋藻原生质球制备和RAPD分析研究

原生质体(球)是生理研究和遗传育种的良好材料,原生质球的制备在节旋藻基因工程中也是不可缺少的实验手段。本论文论述了钝顶节旋藻FACHB341原生质球的制备方法,对已有的制备钝顶节旋藻原生质球的方法进行了改进。文中探索了节旋藻原生质球制备的最佳去鞘方法、缓冲液最佳pH值、最佳渗透稳定剂、最佳的酶组合以及溶菌酶的最佳浓度和酶解时间。

实验结果证明,制备钝顶节旋藻原生质球需要将超声波法、离子法和酶解法相结合,其有利组合如下:取对数期(OD_(560)=0.6～0.8)的钝顶节旋藻FACHB341培养液,置于50mL离心管中进行超声波处理,能量为:3～5W,超声处理1.0s,间歇0.5s,处理2min。3000r/min离心10min,收集沉淀,置于含1.0～1.5mol/LNaCl的Zarrouk培养基中洗涤5min。

3000r/min离心10min,收集沉淀,用无菌Zarrouk培养基洗涤2～3遍,3000r/min离心10min,收集沉淀。沉淀转入酶解液中。酶液组成为:0.2mol/L磷酸钾缓冲液pH7.2,渗透稳定剂KCl0.8mol/L,0.5%溶菌酶。在28℃～30℃水浴低速震荡下酶解5～7小时,低渗爆破法检测原生质球,显微镜下计数细胞总数,经伊文思兰染色液活体染色每隔1.5小时计数原生质球数目,得出活体原生质球得率。

此方法可以得到40%以上有活性的钝顶节旋藻原生质球,为节旋藻的进一步遗传转化以及基因工程研究提供了实验基础。同时本研究对本实验室保存的9株螺旋藻和节旋藻品系:钝顶节旋藻FACHB341、FACHB438、FACHB439、FACHB793、FACHBJP1、OUQDS_6、OUQDS8,极大节旋藻OUQDSM和螺旋藻FACHB351进行了随机扩增多态性DNA(RAPD)研究。

为得到一个稳定的RAPD反应体系,首先对影响反应体系稳定性的主要因子进行了优化,优化结果为:在25μL反应体系中DNA模板用量50ng,Mg~(2+)浓度2.5mmol/L,引物浓度为2μmol/L,10mMdNTP1μL,Taq聚合酶1U。反应程序:94℃预变性10min,然后94℃1min,36℃1min,72℃2min,40个循环,最后72℃下延伸10min。