盐生杜氏藻MAPK基因的克隆及对烟草的转化

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)属于丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,存在于所有真核生物中,通过对丝氨酸/苏氨酸的磷酸化修饰将上游信号传递至下游,对细胞周期的运行和基因表达具有重要调控作用。近年来,越来越多的实验研究表明:MAPK在植物生长发育调节和抗逆等生理过程中起重要作用。

而现今逆境胁迫严重影响植物的生长,因此提高植物抗逆性的研究有着极为重要的现实意义。本实验利用传统的同源克隆方法成功克隆到盐生杜氏藻MAPK基因,并构建了植物表达载体pBI121-MAPK,将其转入根癌农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌介导将其导入烟草中,并对转基因烟草进行检测,借以初步探讨MAPK基因在烟草中的转化情况,为今后在更多牧草上应用提供了依据。

本实验内容和结果如下:

1.盐生杜氏藻MAPK基因的克隆利用同源克隆的技术,从盐生杜氏藻中克隆到一条MAPK基因的cDNA片段(297bp),然后以该片段为基础,利用RACE技术构建其全长序列。

2.植物表达载体pBI121-MAPK的构建利用DNA重组技术,构建植物表达载体pBI121-MAPK,然后将其通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105中。

3.烟草再生体系的建立采用烟草叶片为外植体,以MS_0为基本培养基,筛选出MS_0+6-BA(2㎎/L)+NAA(0.1㎎/L)以诱导不定芽的分化,并于MS_0+NAA(0.2㎎/L)生根培养基上生根,获得完整的再生植株。其叶片分化率达52.4%,生根率达88.5%。

4.转化体筛选及植株再生将预培养2d的烟草叶片用农杆菌菌液浸染10min,共培养2d,然后转化到含Km50㎎/L的选择培养基上进行分化筛选,再转入Km为50㎎/L、75㎎/L的培养基上进行生根筛选,生根率达64.8%,获得转基因植株。

5.转基因烟草分子生物学检测对转基因烟草苗的PCR检测结果显示,有17.6%的再生苗为阳性,测序结果正确,说明pBI121-MAPK已经整合到烟草基因组中。

【关键词】：盐生杜氏藻 同源克隆 MAPK RACE 叶盘转化 转基因烟草

【学位授予单位】：甘肃农业大学