离子注入盐生杜氏藻高产β-胡萝卜素突变株筛选及细胞固定化技术研究

杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种单细胞真核藻类,无细胞壁,含有大量的甘油、胡萝卜素和蛋白质,是极具经济价值和研究价值的藻类。本文利用低能离子束对盐生杜氏藻进行诱变,选育高产β-胡萝卜素的突变菌株,并针对单粒子单细胞辐照的要求,进行了盐藻细胞固定化技术研究,获得如下主要结果:

1.利用10keV能量下不同剂量的低能氩离子注入盐藻,研究了盐藻细胞的存活率和突变率,确定了盐藻氩离子注入最适剂量为1.04×10~(15)Ar~+/cm~2。

2.通过多轮诱变筛选,获得了一株高产β-胡萝卜素的盐藻突变株,命名为CH2,其β—胡萝卜素总含量为15.075mg/L,单细胞β—胡萝卜素含量为2.258p/cell,比原藻株提高了42%。对该藻株进行传代实验,结果表明该藻株在合成β-胡萝卜素性状上具有遗传稳定性。

3.研究了盐藻突变株和原藻株的生长及主要色素积累的变化。结果表明,离子注入后盐藻正突变株生长曲线相对于原藻株有明显上升,生长速度增大,β-胡萝卜素总含量从原来的8.598mg/L增加到14.397mg/L以上,单细胞β—胡萝卜素含量从原来的1.59pg/cell增加到1.996pg/cell以上,叶绿素含量与β—胡萝卜素含量的比值从原来的2.837mg/L下降到2.088mg/L,说明盐藻在进入稳定期之前积累β—胡萝卜素的过程与细胞的生长正相关,只是突变株的生长在进入稳定期后仍有增长空间,β—胡萝卜素在不断累积,叶绿素含量虽有增加,但增长幅度渐趋缓慢。

4.建立了盐生杜氏藻细胞固定化技术体系:对数期第6-7天,NaCl含量为30g/L,细胞固定剂L-多聚赖氨酸(PLL)浓度为1.25mg/mL,剂量为1mL,固定区域直径为2mm,FDA浓度为5mg/mL,剂量为400μL,PI浓度为400μg/L,剂量为210μL,为适合的固定化条件。胰蛋白酶洗脱时间为3～4min,洗脱剂量240～250μL,外加60rpm培养12h可完全洗脱固定细胞。 综上所述,本研究所建立的盐藻离子束辐照技术和获得的高产β—胡萝卜素突变株及单细胞固定化技术,为盐藻的遗传改良和单细胞定位辐照奠定了理论和技术基础。

【关键词】：盐生杜氏藻 β-胡萝卜素 离子注入 单细胞固定