盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆及其结构分析

盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)是极端耐盐的藻类，在植物耐盐研究中是重要的模式生物。该藻通过甘油进行细胞膨压的调节，因此对甘油合成途径上的关键酶3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol-3-phosphatedehydrogenase，简称为GPDH)的研究是至关重要的。本文通过SMART~(TM)技术构建了盐生杜氏藻的全长cDNA文库，测得该文库的平均滴度为1.2×10°cfu／mL，可以代表藻体细胞3.07×10°mRNA片段，重组率为100％。

然后在对文库随机克隆进行测序的同时，运用生物信息学手段寻找到3-磷酸甘油脱氢酶基因的序列表达标签(EST)序列，在这个基础上对3-磷酸甘油脱氢酶全长基因进行了克隆。首先采取亚克隆，测序等手段获得了3-磷酸甘油脱氢酶基因的3’UTR序列，整个EST及其3’端序列总长度为1609bp，包含3-磷酸甘油脱氢酶基因3’端编码序列和3’UTR序列，并发现其中含有一个GT重复序列；其次通过RACE技术在EST的基础上进行基因5’端全长的扩增，整个5’端序列最长为1544bp，包括了3-磷酸甘油脱氢酶基因的5’端编码序列和5’UTR序列；最后对这条cDNA进行了Southern杂交验证，杂交结果表明3-磷酸甘油脱氢酶基因在盐生杜氏藻基因组中含一个拷贝。

同时通过分段PCR的方法，对盐生杜氏藻的基因组DNA进行了部分扩增，获得了8个3-磷酸甘油脱氢酶的内含子，分析发现这些内含子的剪接边界与目前公认的内含子剪接边界相同，同时发现内含子与外显子的GC％含量明显不同并且内含子中具有大量GT重复序列。

运用生物信息学手段对3一磷酸甘油脱氢酶基因核酸以及蛋白质序列做出了分析，发现这个基因编码两种功能的结构域，磷酸化酶结构域和3一磷酸甘油脱氢酶结构域。通过相似性搜索，结构域定位以及结构比较分析我们认为磷酸化酶结构域很可能是催化3一磷酸甘油水解，而3一磷酸甘油脱氢酶结构域是催化3一磷酸甘油合成的，为这个基因功能的鉴定提供了根据.

【关键词】：盐生杜氏藻 3-磷酸甘油脱氢酶 cDNA 文库 Southem杂交 序列表 达标签 内含子 外显子 结构域

【学位授予单位】：四川大学