盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因在苜蓿中的转化及检测

盐碱化是导致我国环境危机的重要因素之一，利用基因工程培育抗旱耐盐品种已成为解决我国盐碱化日益严重问题的一条重要途径。

盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)是一种真核单细胞绿藻，能在0.1-5.5mol／L的NaCl浓度中生存，是目前发现的唯一能进行渗透压调节的单细胞真核光合生物。盐生杜氏藻主要通过集聚甘油进行细胞膨压的调节，因此克隆甘油合成途径中的关键酶3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol-3-phosphatedehydrogenase，简称为DsGPD)基因，确定其在植物抗旱耐盐中的作用十分必要。

本文是在克隆获得盐生杜氏藻具调渗功能的3-磷酸甘油脱氢酶基因(DsGPD)的基础上，应用DsGPD进行苜蓿抗旱耐盐基因工程改造，目的是选育抗旱耐盐苜蓿新品种，这将对于盐碱化土地的改造和治理，扩大优质豆科牧草苜蓿种植面积发挥极其重要的作用。

取得的主要结果如下：

1．首先构建了植物高效表达载体pCAMBIA2301G-DsGPD，成功地将该质粒导入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105中；

2．完成了苜蓿不同转化方法的优化。通过直接侵染、超声波震荡、真空负压法等农杆菌介导转化苜蓿的方法的优化，叶片经超声波和负压处理后，转化效率分别为27.7％和22.2％，比直接浸染分别提高转化效率150％和110％。愈伤组织电击法以电压650V／cm，电容50uF的转化条件为最佳，GUS染色获得的蓝色条带数目最多；

3．建立了苜蓿的转化体系。采用农杆菌介导的方法进行DsGPD基因的苜蓿转化。根癌农杆菌侵染苜蓿外植体后，三月左右胚状体萌发再生芽，通过诱导生根获得完整植株，生根率达到60％左右，最后将再生苗成功移过诱导生根获得完整植株，生根率达到60%左右，最后将再生苗成功移栽到蛙石:沙(l:l)的培养介质中培养;

4.比较了子叶、下胚轴、叶片的转化效率。子叶和叶片更容易被转化，分化率为17%左右。当根癌农杆菌菌液OD二0.3一0.5时，愈伤组织形成率为60%一80%，效果较好;

5.完成了转基因植株的分子检测。获得了转DsGPD基因首稽植株102株，经PCR检测有21%的再生苗为阳性。为进一步功能研究及提高首稽在盐环境下的耐盐性奠定基础。

关键词:盐生杜氏藻;3一磷酸甘油脱氢酶基因;叶盘转化法;紫花首蓓;GUS化学组织染色;根癌农杆菌;愈伤组织;