杜氏盐藻两种碳酸酐酶基因的克隆和启动子功能研究

有关杜氏盐藻(Dunaliellasalina)遗传背景的研究报道很少，已有的研究主要集中于与光合机理有关的杜氏盐藻光系统损伤与修复机制研究和与高度耐盐有关的一些蛋白质或酶的研究等。

在这些研究中，最令许多学者关注的是无细胞壁的杜氏盐藻能在0.05M-5MNaCl环境中生存的分子机制。业已研究发现，杜氏盐藻的低渗或高渗休克除受甘油、离子流动的调节外，还与分子量分别为150KD的转铁样蛋白及60KD的内部双拷贝碳酸酐酶有关，这两种蛋白的含量及其mRNA的水平随培养液中氯化钠浓度的升高而增加。说明这两种蛋白的表达受氯化钠浓度梯度调控，而编码这两种蛋白基因的启动子可能应为高渗休克诱导性启动子。

但迄今为止，有关此类启动子的研究尚未见报道。为此，本课题克隆了杜氏盐藻双拷贝碳酸酐酶(DCA1)和碳酸酐酶(CA1)基因的启动子，并对其功能进行了分析。

结果表明，DCA1基因启动子可驱使外源的抗除草剂基因(bar)在杜氏盐藻细胞中稳定表达，CA1基因启动子可驱使外源的bar基因在杜氏盐藻细胞中瞬时表达。而且DCA1基因启动子还受氯化钠浓度梯度调控，是一种新的高渗休克诱导性启动子。

一、杜氏盐藻两种碳酸酐酶基因的克隆和序列分析

1．方法·2003年博士论文杜氏盐藻(D份naIiellasall’na)两种碳酸醉酶基因启动子的克隆

1.1杜氏盐藻基因组步行文库的构建分别选用平端限制内切酶Dral、EcoRv、Pvun和Stul消化杜氏盐藻基因组DNA，通过酚/氯仿抽提纯化酶切完全的基因组DNA，将之与衔接头连接，分别构建成Dral酶切的文库1(G认飞1)、EcoRV酶切的文库2(GWLZ)、Pvu11酶切的文库3(G认飞3)和Stul酶切的文库4(G认飞4)。

1.2杜氏盐藻两种碳酸配酶基因5’上游区和3’下游区序列的克隆分别根据Genbank登录的杜氏盐藻双拷贝碳酸醉酶(DCAI，登录号AF183939)和碳酸配酶(CAI，登录号AF190735)基因cDNA5’和3’一TR序列，分别设计基因特异性引物。以杜氏盐藻基因组步行文库DNA为模板，分别用基因特异性引物和衔接头引物进行巢式PCR扩增，通过胶回收和蓝白班筛选实验将特异性PCR产物克隆到T一载体上。

1.3杜氏盐藻DCAI和CAI基因跨内含子DNA序列的克隆分别根据Gellbank登录的杜氏盐藻DCAI和CAI基因cDNA的5’一UTR和3’一UTR序列，设计正向和反向跨内含子PCR引物，以杜氏盐藻基因组DNA为模板进行PCR扩增，通过胶回收和蓝白班筛选实验将特异性PCR产物克隆到T一载体上。

1.4测序和序列分析采用双脱氧末端终止法对酶切鉴定正确的克隆载体进行测序，用DNA分析软件对所得DNA进行序列分析。

2.结果

2.1杜氏盐藻DCAI和CAI基因5’上游区的克隆和序列分析对DCAI基因在GWLI中扩增出的大小约为1.3kb特异PCR产物和CAI基因在GWLZ中扩增出的大小约为1.7kb特异PCR产物的序列分析结果表明，1.3kb和1.7kb特异PCR产物的3’端序列分别与己知DCAI和CAI基因cDNAS’端序列完全相同，而且在这两个PCR产物序列中均含有多个与转录调控有关的保守顺式调控元件及富含郑州大学2003年博士论文杜氏盐藻(Dunaliella胡肠刀口)两种碳酸醉酶基因启动子的克隆和功能研究GT的高度重复序列。

2.2杜氏盐藻DCAI和CAI基因3’下游区的克隆和序列分析对DCAI基因在GWL3中扩增出的大小约为1.7kb特异PCR产物和CAI基因在GWLI中扩增出的大小约为0.75kb特异PCR产物的序列分析结果表明，1.7kb和0.75kb特异PCR产物的5’端序列，除个别碱基可能是由于PCR本身错误或测序误差与己知DCAI和CAI基因cDNA序列不同外，其它序列与已知DCAI和CAI基因cDNA3气UTR序列完全相同。

2.3杜氏盐藻DCAI和CAI基因跨内含子基因组DNA的克隆和序列分析对通过跨内含子PcR扩增得到的DCAI基因一个约4100bP特异PcR产物和cAI基因一个约420obp特异PCR产物的序列分析结果表明，DCAI基因跨内含子DNA长度为44O7bp，含7个外显子，除第4一7外显子中的5个碱基外，其余编码区序列与己知DCAI基因cDNA编码区序列完全一致;CAI基因跨内含子DNA长度为4473bp，含8个外显子，除第4一6外显子中的8个碱基外，其余编码区序列与已知CAI基因cDNA编码区序列完全一致。此外DCAI和CAI基因跨内含子基因组DNA序列的所有外显子一内含子交接点处序列都遵守GT一AG规律。

二、杜氏盐藻两种碳酸醉酶基因启动子的克隆和功能分析

1.方法杜氏盐藻DCAI和CAI基因启动子区的克隆和序列分析

根据己克隆得到的DCAI和CAI基因5’上游区的5’端序列和DCAI和CAI基因cDNAS’一UTR的3’端序列，设计正向和反向PCR引物，以杜氏盐藻基因组DNA为模板进行PCR扩增，将得到的特异性PCR产物克隆到T一载体上，得到克隆载体pMI)DCAI和pMD一CAI，而后进行测序和序列分析。

郑州大学2003年博士论文