杜氏盐藻外源基因转化系统的建立

本文以杜氏盐藻(Dunaliellasalina)为研究对象，建立了杜氏盐藻外源基因的转化系统，为下一步杜氏盐藻转化植酸酶基因的研究奠定了基础。

本文主要的研究内容及结果如下：本文从盐藻培养液中分离到5种菌，选择了卡那霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素、氯霉素、链霉素、新霉素7种常用的抗生素对其进行敏感性实验，筛选出链霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素，氯霉素5种菌较敏感的抗生素，并通过实验得出这几种抗生素之间的作用是累加的。

考察了不同浓度的链霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素，氯霉素对盐藻生长状况的影响，结果表明氯霉素对盐藻的生长有很大的抑制作用，盐藻对于氯霉素最为敏感，而其它4种抗生素浓度达到1600μg／mL，培养10天时，藻的生长状态仍较好；选用链霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素进行联合除菌，结果显示当每种抗生素的浓度均为800μg／mL、处理3次后，用平板法分离纯化盐藻可得到无菌的盐藻。选择了氯霉素、G418、潮霉素3种抗生素做盐藻基因工程选择标记实验。

结果表明氯霉素可以作为盐藻基因工程的筛选抗生素，CAT基因为其阳性筛选标记基因，固体培养基筛选浓度为80μg／mL。优化了无菌盐藻的培养条件。对C、N、P三种大量元素和维生素进行了优化。

在单因素实验的基础上做了四因素三水平正交实验，得到优化组合为NaNO_3和NaH_2PO_4为f／2培养基的10倍、NaHCO_30.4g/L、V_(B1)100μg／L、V_(B12)1.0μg/L，其他营养盐按f／2培养基添加。

利用电击法将GFP基因转入到无菌杜氏盐藻细胞中，研究了电击转化条件、藻的生长状态对转化率的影响，结果得出培养7天的盐藻细胞在3KV的脉冲电压、3ms的脉冲时间下可获得较高的转化率，为转化的最优条件。