建立盐藻遗传转化系统的研究

盐藻(Dunaliellasalina)是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻,可以用作研究植物细胞对胁迫反应的模式生物,也具有重要的生物工程应用价值。盐藻的遗传转化是对盐藻进行分子遗传学研究的必需技术。

本论文介绍了解决这一问题的主要研究工作:

(1)、研究盐藻电击转化中电场强度对细胞存活和外源DNA导入效率的影响,确定了盐藻电击转化的基本参数;把含有ble基因的质粒通过电击转化导入盐藻细胞,检测到ble基因在72小时内能够滞留和转录表达;随后在含有抗生素Zeocin的培养基上得到了抗性转化子,Southern分析表明在6个月的传代培养后在细胞中仍然能够检测到转化质粒,但随着进一步传代培养逐渐丢失。

(2)、从盐藻cDNA文库和基因组文库中筛选得到硝酸还原酶cDNA及其基因,序列分析表明与其它真核藻类中硝酸还原酶基因同源性达到75%,相似性达到89%;Northern分析表明该基因的转录表达受到硝酸盐诱导,在诱导后6小时达到最高表达;构建含有盐藻硝酸还原酶cDNA片段的转化载体,在硝酸还原酶基因缺陷的莱茵衣藻中得到了互补表达。

(3)、利用亚硝基胍诱变、氯酸盐富集的方法筛选得到39株稳定的硝酸还原表型缺陷的盐藻突变体;Southern分析显示突变体B14有明显的基因片段缺失,PCR和序列测定显示该突变体缺失了1314bp基因组片断,包含有223bp编码区序列;利用野生型硝酸还原酶基因互补转化突变体B14,得到了表型互补的转化子,但没有发现转化基因插入现象。

以上的工作明确了盐藻电击转化的主要条件,并分离鉴定了建立互补转化系统的供体和受体,将有助于对盐藻的遗传转化进行更深入的研究。